脂质体流感疫苗制备及体液免疫应答

1、脂质体流感疫苗制备及体液免疫应答【摘要】目的：制备脂质体流感疫苗并对其体液免疫效果和保护效率进展研究。方法：采用薄膜法与冷冻枯燥法相结合的方法制得多层脂质体；用制得的脂质体流感疫苗和普通疫苗分别免疫小鼠，用血凝抑制实验hi和酶联免疫吸附试验elisa对免后213周的小鼠血清的抗体程度进展检测，hi检测其特异性抗体，elisa检测igg抗体程度并对小鼠的保护效率进展检测。结果：实验中，脂质体流感疫苗在2g/use组和4g/use两个剂量组中，不同免疫时间内其hi值可分别较非脂质体疫苗组高出23和4倍，产生抗体的程度经elisa实验得出较非脂质体疫苗组高出1倍左右，故可激发更高的体液免疫；保护效力

2、为4/6。结论：脂质体流感疫苗可以刺激机体产生更高的体液免疫和更高的保护效力。【关键词】流感疫苗脂质体体液免疫血凝抑制试验llegeflifesiene,hanghununiversityfsieneandtehnlgy,hanghun130022,hina;llegeflifesiene,jilinuniversity,hanghun130021,hina;hanghuninstitutefbilgialprduts,hanghun130062,hinakeyrdsinfluenzavaine；lipse；huraliunizatin；hitest1材料与方法1.1流感病毒和抗原a/alif

3、rnia/7/2022(h3n2)毒株及抗原由长春生物制品研究所疫苗六室提供。1.2实验动物6周龄干净级雌性balb/小鼠，体重1820g，由长春生物制品研究所动物室提供。1.4脂质体流感疫苗的制备采用薄膜法与冷冻枯燥法相结合的方法制得多层脂质体，步骤如下：氢化大豆卵磷脂p德固赛公司，德国和胆固醇siga，美混合溶于氯仿，40真空旋转蒸发，成膜5。加水，剧烈震荡，水浴超声约1小时致淡云雾状，按比例与流感裂解疫苗混合，冻干。1.5脂质体流感疫苗的性质研究1.5.1脂质体的形态学观察分别用高倍显微镜100物镜及电镜对制得的脂质体进展形态学观察。1.5.2脂质体的粒径分析室温下用zetasizer3

4、000hs激光衍射粒度分析仪对制得的脂质体粒径进展分析，测定其粒径分布和平均粒径。1.5.3脂质体包封率的测定采用lry法，测定上清中的蛋白质含量。1.6脂质体流感疫苗的体液免疫效果评价1.6.1balb/小鼠的免疫小鼠分为5组，每组5只，用2g抗原/只和4g抗原/只的剂量分别对其进展免疫，设脂质体流感疫苗组，流感抗原组并设对照组。1.7脂质体流感疫苗的保护效果评价8由于流感病毒感染几乎不会造成动物个体的死亡，其疫苗的保护效率只能通过疫苗对感染小鼠的肺部的保护率来表达。用0.02l流感病毒鸡胚尿囊液10-8.0eid50对免后12周的小鼠进展鼻腔攻击。6天后，处死小鼠，无菌取肺，观察其病灶的多

5、少，没有肺部病灶的小鼠认为受到保护，用dk细胞检测小鼠肺部的流感病毒滴度肺部病毒滴度定义为可以引起pe的肺内容物的最大稀释倍数。2结果2.1脂质体流感疫苗的性质2.1.1形态观察为了验证制得的脂质体的根本形态和其直径的大致范围，由高倍显微镜及透射电镜观察可见，该方法制备的脂质体呈圆形或椭圆形，粒径分布较均匀，直径大约在微米级，证明了制得的脂质体的完好性，其粒径符合粒径测定要求，见图1和图2。2.1.2粒径测定结果为了更准确的测得脂质体粒径，室温下用zetasizer3000hs激光衍射粒度分析仪对制得的脂质体的粒径进展分析，测定其粒径分布和平均粒径。可见80%以上的脂质体粒径在3.8635.3

6、5之间，这个粒径范围说明了制得的脂质体可大大增强其结合抗原的抗原性，见图3。图1脂质体流感疫苗的电镜照片略fig.1theeletrnirgraphsfinfluenzasplitviruslipse图2脂质体流感疫苗的100显微镜照片略fig.2the100irgraphfinfluenzasplitviruslipse图3用alvernzetasizer3000hs激光粒度分析仪粒径测定结果略fig.3thediaeterdistributinflipsesdeterinedbyalvernzetasizer3000hs2.1.3包封率测定为了测定脂质体对流感抗原的包封率，采用lry法分别

7、测定脂质体悬液的总蛋白量为155.75g及其除去脂质体后上清液中蛋白量为13.35g，按公式计算得脂质体包封率为91.1%，说明了制得的脂质体对流感疫苗具有较高的包封效率。2.2脂质体流感疫苗的免疫效果表1免后213周的小鼠hi结果略表2免后213周小鼠elisa结果略表3脂质体流感疫苗对免后12周小鼠的保护效力tab.3prtetinagainsta/alifrnia/7/2022(h3n2)virusinfetininpreiunizedbalb/ie2.2.1hi测定特异性抗体结果为了检测脂质体流感疫苗的特异性免疫效果，采用hi测定免后一段时间的小鼠血清，对实验结果应用spss11.5软

8、件进展统计分析：nnlipsal、lipsal和对照组两两相比，组间有显著性差异p0.01。2g/use组和4g/use两个剂量组比照可以得出，4g/use组的脂质体疫苗组的hi指数进步的更多，为非脂质体疫苗组的4倍左右，可见高剂量组免疫效果优于低剂量组。随着免疫时间的延长，hi指数逐渐升高，在46周到达峰值，两个剂量组都显示非脂质体疫苗组hi值升高缓慢，峰值较低。而脂质体疫苗组hi值迅速升高，峰值较高，见表1，该结果证明了脂质体流感疫苗可产生较同等剂量的非脂质体疫苗高得多的特异性抗体。2.2.2elisa测定igg结果为了进一步检测脂质体流感疫苗刺激小鼠机体产生igg抗体程度，采用elisa

9、法对免后一定时间的小鼠血清进展测定。该elisa试验所测的样品均为10倍稀释后的血清样品。测定的结果应用spss11.5软件统计分析：nnlipsal、lipsal和对照组两两相比，组间有显著性差异p0.01。2g/use组和4g/use两个剂量组比照可以得出，4g/use组的脂质体疫苗组的igg程度进步的更多，为非脂质体疫苗组的2倍左右，可见高剂量组免疫效果优于低剂量组。随着免疫时间的延长，igg程度逐渐升高，在46周到达峰值，两个剂量组都显示，非脂质体疫苗组igg程度升高缓慢，峰值较低。而脂质体疫苗组igg值迅速升高，峰值较高。试验结果证明，脂质体流感疫苗组可刺激机体产生较非脂质体流感疫苗

10、为高的igg抗体，见表2。2.3保护性试验为了获得脂质体流感疫苗对机体抵抗流感病毒更直接和可信的数据，进展了保护性试验，结果显示，脂质体流感疫苗组保护率最高，肺内容物流感病毒滴度最低。说明了脂质体流感疫苗对机体的保护效果要高于非脂质体流感疫苗，见表3。3讨论机体对外界细菌和病毒的抵抗主要存在两个免疫途径：一是体液免疫，二为细胞免疫。体液免疫主要是由b细胞介导的，免疫后导致机体合成抗ha、na等主要糖蛋白的抗体，血清抗体主要为3种免疫球蛋白：igg、ig和iga，与其他病毒感染一样，最初应答为ig，然后才是限制病毒再感染的iga和igg。体液免疫应答最终效应是将侵入机体的非己细胞或分子加以去除，

11、即排异效应。但抗体本身只具有识别作用，并不具有杀伤或排异作用，因此体液免疫的最终效应必须借助机体的其它免疫细胞或分子的协同作用才能到达排异的效果。主要有：抗体分子的中和作用；抗体分子的调理作用；补体介导的细胞溶解作用；抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。本试验采用脂质体做佐剂包封流感疫苗，通过血凝抑制实验hi和酶联免疫吸附试验elisa对免后几周的小鼠血清的抗体程度进展检测，hi检测其特异性抗体，elisa检测总抗体程度。在免后12周用活毒a3h3n2eid50=10-8.0对小鼠进展攻击，1周后检测小鼠肺部病变，测得疫苗对小鼠机体的保护效率。hi及elisa实验说明，脂质体流感疫苗较单纯抗原具有明

12、显的优势，一样剂量下，脂质体流感疫苗可激发更多的抗体；免疫后小鼠血清中的抗体顶峰期持续时间较长。疫苗的保护效率无佐剂疫苗为2/6，相应脂质体流感疫苗为4/6。实验过程中，我们认为有几个值得注意的方面：注射途径的问题：注射途径一般有肌肉注射、腹腔注射、皮内注射、皮下注射和静脉注射。我们分别采用以上途径对小鼠进展免疫，4周后采血测其hi，从而得出在本实验条件下各注射途径产生的免疫效果由强到弱依次为：静脉腹腔肌肉皮下皮内。鉴于静脉注射难度较大，故我们采用了免疫效果较强的腹腔免疫途径。脂质体粒径大小的问题：脂质体粒径对脂质体疫苗的免疫效果影响很大，理论上说，粒径越大免疫效果越强，故作为佐剂一般制备lv型脂质体。但粒径过大给后段的除菌造成很大的困难。故脂质体粒径适中是脂质体制备过程中的一个难题。我们发现，脂质水化过程中的超声时间是影响脂质