卫生微生物课件：第2章 卫生微生物学研究与检测方法

1、2022/9/10卫生微生物研究与检测方法1第2章 卫生微生物学研究与检测方法 卫生微生物学 Sanitary Microbiology 2022/9/10卫生微生物研究与检测方法2教学要求熟悉样品采集及运送原则、实验室检验原则及质控方法、常用的分型鉴定方法。掌握卫生指示微生物的类型及意义、定量计数方法。了解卫生微生物检验对人员能力的要求。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法3第1节 卫生微生物学检测特点及基本原则一、检测的特点二、样品的采集原则三、样品的运送原则四、实验室检测原则基本原则2022/9/10卫生微生物研究与检测方法4一、卫生微生物检测的特点（1）卫生微生物研究微生物与环境

2、的关系; 如何影响人类健康;消除其危害的对策。检测对象病原微生物;非致病微生物;条件致病微生物。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法5一、卫生微生物检测的特点（2）标本来源人体；空气、水、食品等。致病菌在环境标本中数量低相应的采样方法、采样量、样品处理方法；可靠快速敏感的检测方法。卫生学评价卫生指示微生物。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法6二、样品的采集原则采样的代表性与针对性ISO/IEC17025:2005检测和校准实验室能力的通用要求:量、部位、时间、随机性、均匀性、按批号、来源、加工方法、保藏、销售各环节、人员卫生水平等。食品安全国家标准GB/T 4789.1-2010

3、食品卫生微生物学检验 总则 除整件抽取外，采样量均为250g或ml。水土壤空气化妆品医疗卫生用品查病因？监测与评价？2022/9/10卫生微生物研究与检测方法7其它采样原则无菌操作：GB/T 4789.1-2010 食品卫生微生物学检验 总则3.2.1。避免杀灭和引入新的抑菌物质。如消毒剂残留。保护目的微生物，中和样品中残留的抑菌物质。样品标记： GB/T 4789.1-2010, 总则。3.4 采样标签 采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚（品名、来源、数量、采样地点、采样人及采样时间等）（送检单）。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法8以传染源追踪为目的的样品采集参考疾病表

4、现及流行病学调查资料；标本类型包括：呕吐物、排泄物、血液、相应的组织、食品、食品原料及生产环节取样、水等环境样品等。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法9三、样品的运送原则尽快送检：一般不超过3-4h。死亡？繁殖？保护待检微生物：包括低温（淋病奈瑟菌除外）；加保护剂；运送培养基；对于血样要防溶血。根据生物安全规定，妥善包装待运输的标本。如H5N1病毒、SARS病毒等。完善的样品交接ISO/IEC17025:2005 5.8.1实验室应有用于检测和/或校准物品的运输、接收、处置、保护、存储、保管和/或清理的程序。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法10四、实验室检验原则具有相应的硬件

5、设施5.2设施和环境条件生物安全合格的人员、标准的方法5.1人员 5.3检测方法及方法确认加强实验室质量控制特殊措施2022/9/10卫生微生物研究与检测方法11（一）硬件设施ISO/IEC17025:2005 5.2设施和环境条件5.2.2 有关规范、方法和程序有要求或对结果的质量影响时，实验室应监测、控制并记录环境条件5.2.3 应将不相容活动的相邻区域进行有效隔离。应采取措施以防止交叉污染 。真菌检测实验室的布局PCR实验室的分区GB 19489-2008实验室生物安全通用要求2022/9/10卫生微生物研究与检测方法121、微生物危害等级(GB 19489-2008)GB 19489-

6、2008实验室生物安全通用要求分级依据: 已与国际接轨。微生物的致病性；传播方式和宿主范围；当地人群的免疫水平；具有的有效预防措施等；分级3.1 危害等级I （低个体危害，低群体危害）3.2 危害等级 (中等个体危害，有限群体危害)3.3 危害等级 III （高个体危害，低群体危害）3.4 危害等级 (高个体危害，高群体危害)2022/9/10卫生微生物研究与检测方法13危害程度具体说明：危险等级I （低个体危害，低群体危害）：不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子 。危险等级 (中等个体危害，有限群体危害) ：能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜

7、或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限 。如沙门菌、志贺菌等。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法14危害程度具体说明：危险等级 III （高个体危害，低群体危害）：能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。如SARS、禽流感等。 危险等级 (高个体危害，高群体危害)：能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。如天花病毒等。2022/9/10卫生微生物研究与检

8、测方法152、生物安全实验室不同危害等级的微生物检验要采用不同等级的生物安全防护。生物安全分级（BSL）生物安全防护水平。 实验室的操作规程和技术 标准的操作规程 特殊的操作规程 安全设备（一级屏障） 特殊设计和建筑要求（二级屏障）2022/9/10卫生微生物研究与检测方法16与危害等级对应，生物安全水平4个级别：一级的防护水平最低，四级防护水平最高。用BSL（Biosafety level）-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示实验室相应的生物安全防护水平，也称为P(Protect)1、P2、P3、P4。 BSL-4 （P4）生物安全等级最高。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法

9、17BSL-1 （P1）实验室已知实验对象不会致病适用范围：适用于基础教学和研究，以及处理已知熟悉其特征、通常对健康成人不致病的生物因子。枯草杆菌、等为BSL-1防护的代表生物因子。建筑要求：无须特殊选址，无需设清洁区与污染区，根据工作需要在实验建筑物内选择普通房间即可满足要求，但应有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计。实验室的墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水、耐化学品和消毒剂的腐蚀。低个体危害，低群体危害2022/9/10卫生微生物研究与检测方法18BSL-1 （P1）实验室人员的要求：应参加过实验室操作培训和安全培训；科研管理人员监督。安全设备与个人防护：BSL-1代表生物安全防护的

10、基本水平，一般不需要特殊的防护装置和设备。基本的安全设备包括：应着实验服，若手部皮肤有破损应带手套，若操作中有有害物质飞溅，则应佩戴保护性眼罩。低个体危害，低群体危害2022/9/10卫生微生物研究与检测方法19典型的一级生物安全实验室布局低个体危害，低群体危害2022/9/10卫生微生物研究与检测方法20BSL-2（P2）实验室实验对象与人类疾病相关适用范围：适用于临床、诊断、教学及其他处理具有中等危险的当地生物因子（存在本社区并引起不同程度的疾病）。对人的血液、体液、组织或原代人细胞系等是否存在未知感染性生物因子的标本进行操作，应采用此类生物安全水平。沙门氏菌、弓形虫、乙肝病毒等是BSL-

11、2防护的代表性生物因子。主要危险：BSL-2条件下的主要危险来源于意外地经皮肤或黏膜接触或摄入感染性物质。中等个体危害，有限群体危害2022/9/10卫生微生物研究与检测方法21BSL-2 （P2）实验室建筑要求：可以是常压状态，也可是负压状态。负压状态的生物安全防护性能高于常压状态。 （1）常压状态BSL2实验室：除满足BSL1的要求外，还应满足的条件有 实验室门应带锁并可自动关闭。实验室的门应有可视窗； 应有足够的存储空间摆放物品以方便使用； 应有良好的通风，如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗； 在配备有生物安全柜的实验室应预留相应风口。中等个体危害，有限群体危害（2）负压状态BSL2实验室

12、： 平面设置：应设更衣室、缓冲间、主实验室。根据需要还可设准备间和洗消间。有条件者可根据需要设淋浴室与样品库。 室内环境指标：空气调节宜采用全新风系统，气流由洁净区流向污染区。 除满足常压状态BSL-2实验室的一般要求外，宜在安全区域醒目位置设压力显示和报警装置。（3）墙体内表面必须光洁、防水、耐腐蚀、易于清洁消毒，所有缝隙必须加以密封。结构材料通常采用彩钢板。地面应无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀。室内所有阴角均采用圆弧线条密封。缓冲间的门应自动联锁。4、设施要求：除满足BSL-1的要求外，还应符合以下条件： 贮存限制性病原体的实验室门窗必须加锁； 建立新实验室时应尽量远离公共区域并进行有效的隔

13、离； 安装生物安全柜的实验室内，其供气和排气引起的波动不应超出生物安全柜的容许范围； 应有一个方便的眼部冲洗台，必要时设应急喷淋装置； 有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等应设备用电源； 在实验室所在的建筑内应配备高压蒸汽灭菌器。5、人员的要求：实验人员需受过处理病原体的特定训练和安全培训，并由经验丰富的专家指导工作。 6、安全设备与个人防护：（1） 配备生物安全柜(最好为二级)。（2） 高浓度或大量传染性病原体须离心时，应使用封口的转头或离心安全杯方可在开放实验室离心，否则只能在生物安全柜内进行。（3）须在生物安全柜外进行操作时，需进行面部防护，以防传染性

14、物质或其他危险物质喷到面部。（4）在实验室内应穿防护性专用工作服。离开实验区域进入非实验区域前应脱下工作服。所有的工作服应在实验室中处理或送至专门地方清洗。（5）当手有可能接触到传染性物质、污染的台面或设备时应戴手套，最好带双层手套。一次性手套不得冲洗、重新利用或触碰清洁台面(如键盘、电话等)。脱掉手套后应洗手。高压蒸汽灭菌器自动喷淋装置2022/9/10卫生微生物研究与检测方法26典型的二级生物安全实验室布局中等个体危害，有限群体危害2022/9/10卫生微生物研究与检测方法27我国大多数CDC、医院、检验检疫机构的工作均可在P2实验室完成。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法28BS

15、L-3 （P3）实验室实验对象是已知或新的与人类疾病相关的物质，具有气溶胶传播的潜在可能适用范围：适用于在临床、诊断、教学、科研或生产设施中进行涉及具有潜在呼吸道传染性的内源性或外源性生物因子的工作，若因暴露而吸入此类生物因子会引发严重的、可能致死的疾病。结核分支杆菌、圣路易脑炎病毒、伯纳特考克斯体等是BSL-3 防护代表性生物因子。主要危险：BSL-3条件下的主要危险源于经皮肤破损处自身接种、经口摄入以及吸入感染性气溶胶。高个体危害，低群体危害建筑要求：应为独立（相对）封闭区域。（1）布局：由清洁区、半污染区和污染区组成。污染区和半污染区之间设缓冲间。在半污染区应设供紧急撤离使用的安全门。在

16、污染区与半污染区之间、半污染区和清洁区之间设置具互锁功能的传递窗，窗内应设物理消毒装置。（2）室内环境指标：BSL-3实验室的主实验室相对于大气的压强为-30Pa-40Pa，相邻房间压差为10Pa15Pa。 污染区和半污染区的静态洁净度达到7级到8级。主实验室最低照度不低于350Lx，其他辅助用房的照度符合工作需要。温度宜为18-25，相对湿度宜为30%-60%。设施要求： 实验室应有良好的自动控制系统。 须在实验室入口处显著位置设压力显示和报警装置，显示污染区、半污染区的负压状况。 在污染区和半污染区出口处设洗手装置。洗手装置的供水应为非手动开关。供水管应安装防回流装置。不得在实验室内安设地

17、漏。不排蒸汽的高压蒸汽灭菌器。人员的要求：实验人员应受过特殊训练和安全培训，掌握处理致病性或致死性病原体的措施，并且在有经验的专家指导下进行操作。 安全设备与个人防护：（1）实验均需在生物安全柜或其他基本防护设施中进行。（2）污染区内应设置不排蒸汽的高压蒸汽灭菌器或其他消毒装置。（3）可能产生气溶胶的设备应置于密闭排风罩（包括通风柜）内进行操作，气体经高效过滤后排出。（4）处理感染性材料、可能污染的仪器以及工作表面时，戴双层手套。（5）当生物安全柜不能安全地控制气溶胶时，实验室中的所有工作人员均要佩戴呼吸保护装置。P3实验室建设和维持费用均较高，不宜盲目建设。2022/9/10卫生微生物研究与

18、检测方法32典型的三级生物安全实验室布局2022/9/10卫生微生物研究与检测方法33BSL-3实验室设施（二级屏障）高个体危害，低群体危害2022/9/10卫生微生物研究与检测方法34BSL-4（P4）实验室实验对象具有致命危险适用范围：适用于进行非常危险的外源性生物因子或未知的高度危险的生物因子的操作。对于与BSL-4生物因子有相似或相同特性的生物因子，在未鉴定前，也应采用此级水平进行操作。主要危险：源于通过呼吸道吸入感染性气溶胶，通过粘膜或破损处皮肤接触到感染性液滴以及自身接种。高个体危害，高群体危害2022/9/10卫生微生物研究与检测方法35BSL-4实验室设施（二级屏障）2022/

19、9/10卫生微生物研究与检测方法36工作人员穿着正压防护服安全设备（一级屏障）危险度等级生物安全水平实验室类型 实验室操作 安全设施1 级基础实验室一级生物安全水平基础的教学、研究不需要GMT （优良的微生物学技术）控制进入。穿戴防护服和手套2 级基础实验室二级生物安全水平初级卫生服务诊断、研究GMT 加防护服、生物危害标志危险警示标志，BSC （生物安全柜）用于防护可能生成的气溶胶，废弃物。笼具在清洗前先清除污染。3 级防护实验室三级生物安全水平特殊的诊断、研究在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流控制进入。所有操作均在BSC中进行。穿特殊防护服。4 级最高防护实验室四级

20、生物安全水平危险病原体研究在三级生物安全防护水平上增加气锁入口、出口淋浴、污染物品的特殊处理严格限制进入。进入前更衣，离开时淋浴，穿着正压服、双开门高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气。所有器具在清洗前先清除污染。与微生物危险度等级相对应的生物安全水平、操作和设施 2022/9/10卫生微生物研究与检测方法38一级屏障（primary barrier）是操作者和被操作对象之间的隔离，也称一级隔离。如生物安全柜（装配有高效粒子气流过滤器HEPA的防污染装置）。据结构、气流速度和类型、排气方式分3级-I、II、III级。个体防护装备 口罩、面具、眼镜，防护衣、帽、裤、鞋、靴、袜、手套、正压服等。2

21、022/9/10卫生微生物研究与检测方法39一级屏障2022/9/10卫生微生物研究与检测方法40防护服2022/9/10卫生微生物研究与检测方法41二级屏障(secondary barrier)生物安全实验室和外部环境的隔离，也称二级隔离 实验室的设施结构通风空调系统 给水排水电气和控制系统二级隔离的防护能力取决于实验室分区和定向气流 一般按照实验因子污染的概率把实验室分为洁净、半污染和污染三个区。 2022/9/10卫生微生物研究与检测方法42传统无菌室简易型介绍这种传统的无菌室为密闭小间；由更衣间、缓冲间、无菌操作间以及相应的准备间所组成，为严密的结构屏障；培养平皿暴露30分钟 进行检查

22、，经过24-72h 培养后生长的菌落数不超出3个即认为符合要求。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法43传统无菌室送风型(乱流洁净室）将经过玻璃纤维之类低阻力过滤器净化的新鲜空气以一定风速送入室内，对原有的空气进行稀释或置换，保持每小时换气15-20 次，以达到净化目的。这类无菌室需要维持较高的正压，在严格的控制条件下，仅能接近10级的净化水平。可以设置洁净工作台。通常将洁净工作台设计制造成100级的净化水平，当原有室内洁净度达10万级时，空运转20-30min 后即可达到100 级的水平。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法44洁净实验室将净化的层流空气对整个房间进行净化处理后称

23、为洁净室。空气由房间一侧墙面的通风净化系统沿水平方向通过操作空间，再由相对方向一侧墙面的栅格流出，经过天花板上夹层空隙回流或排放的形式，称为水平层流洁净室。由天花板上夹层的通风净化系统将空气按照垂直方向自上而下通过操作空间，再经地板栅格下面的夹层空隙回流排放的形式则称为垂直层流洁净室。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法452022/9/10卫生微生物研究与检测方法46洁净度的等级分类洁净度的等级系以操作区内尘埃颗粒的大小和数目两项指标作为划分依据；美国联邦标准 “洁净室与洁净工作台的环境标准”，以每28.32L空气中含有0.5m的尘埃粒子数102 颗、104 颗、105 颗作为等级的名

24、称，即100级、10000 级、100000 级。该等级换算成国际单位的每升粒子数则为3.5 颗、350 颗、3500 颗。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法47国际上常用的洁净等级表对于浓度很小的测定值，除非有足够的大量取样提供确凿的数据，否则可靠性差。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法48几点提示一些健康相关产品的检测标准提出了100级洁净度的要求， 100级洁净实验室是必需的。洁净实验室不能代替生物安全实验室生物安全实验室不允许正压；洁净实验室仅提供了对样品的保护。生物安全实验室有洁净度的要求，但要求不高。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法49(二)合格的人员及标

25、准/方法人员资格与培训；采用标准或公认的方法。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法50ISO/ICE 17025:2005 5.2人员5.2.1 教育、培训、经验和/或可证明的技能。5.2.2 教育、培训和技能目标。5.2.5 实验室应保留所有技术人员、包括签约人员的相关授权、能力、教育和专业资格、培训、技能和经验的记录。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法511、人员资格与培训考核评估指标细菌计数；生化试验重现性；模拟样品检出考核：盲检。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法52细菌计数分散性和稳定性好的细菌；910cm的普通琼脂平板，表面涂沫计数，重复5次；计算平均数与标准

26、差；评价。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法53生化试验重现性用铜绿假单胞菌作生化试验3次，观察结果重现性；分解葡萄糖和木糖产酸不产气；硫化氢实验（阴性）；氧化酶实验（阳性）；精AA、赖AA脱羧酶试验（阳性和阴性）；七叶苷试验（阴性）。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法54模拟样品检出考核：盲检选择合适的基质和指示菌；成倍（5、10）量加入；盲检。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法55ISO/ICE 170255.4检测和校准方法及方法确认优先使用以国际、区域或国家标准发布的方法； 确保使用标准的最新有效版本；如果必须使用标准方法中未包含的方法（非标方法），应征得客户同

27、意； 所有使用的方法都须经过确认（包括标准方法）。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法56（三）加强实验室质量控制仪器设备校准和培养试剂的质量监控；消毒灭菌效果监控；实验记录与核查；报告质量要求。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法57ISO/ICE 17025:2005 5.5设备定期检定和校准使用前核查期间核查维护保养状态标识2022/9/10卫生微生物研究与检测方法58培养基试剂质量4.6.1应有与检测和校准有关的试剂和消耗材料的购买、验收和存储定期检定和校准的程序；4.6.2确保所购买的、影响检测和/或校准质量的供应品、试剂和消耗材料，在经检查或证实符合有关检测和/或校准方

28、法中规定的标准规格或要求后才投入使用。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法59消毒灭菌效果嗜热脂肪芽孢杆菌（55oC,5d）灭菌效果指示片无菌试验2022/9/10卫生微生物研究与检测方法60加强记录和核查4.12.2技术记录 如可能，每项检测或校准的记录应包含足够的信息，并保证该检测在尽可能接近原来条件的情况下能够复现；记录应包括负责抽样、从事各项检测和/或校准的人员和结果校核的人员的标识。 2022/9/10卫生微生物研究与检测方法61技术记录（续）观察结果、数据和计算在工作的同时予以记录; 该记录按照特定任务分类识别; 如果记录出现错误，对每一错误进行划改，并在旁边填写正确值，而不

29、是擦掉、涂掉，以免字迹模糊或消失;对记录的所有改动有改动人的签名或签名缩写。 2022/9/10卫生微生物研究与检测方法62报告质量5.10 结果报告 信息充分规范（计量单位）签发人签字，单位盖章检验者、复核者不一定签字2022/9/10卫生微生物研究与检测方法63报告说明报告结果的层次（初步报告和确诊报告）和时限要求；初步报告是在得到病原微生物的纯培养前，根据快速检验结果所作的报告，一般在1024h内完成。对细菌、霉菌、酵母菌菌落总数的测定，一般样品以1g/100g或1ml/100ml为单位的菌落形成单位cfu表示。表面涂擦采样或空气采样以1cm2或m3为单位的cfu表示，即cfu/ cm2

30、（m3 ） 。致病菌或特定检验菌：一般以1g或1ml为单位报告“检出”或“未检出”。最可能数法MPN（most probable number）检验结果可报告为:大肠菌群数3个/L或40个/100g，或大肠杆菌MPN/10040。水和食品一般以100ml或100g为单位报告（2010版变为ml或g）。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法64（四）根据卫生检验特点采取特殊措施做好应对突发事件的准备采样物品试剂器材检测方法微生物检验优先恰当的样品处理与检验（按相关标准进行）均质化抑菌作用去除损伤菌株复苏2022/9/10卫生微生物研究与检测方法65第2节：卫生指示微生物Hygiene ind

31、icator microorganisms在常规卫生监测中，用以指示检品卫生状况及安全性的（非致病）微生物（或细菌）2022/9/10卫生微生物研究与检测方法66indicator organisms Species very sensitive to changes in the environment, and whose presence or absence may be indicative of environmental conditions in a particular area or habitat. They serve the same purpose as the c

32、aged birds kept in old mines whose sudden death indicated presence of carbon monoxide. 2022/9/10卫生微生物研究与检测方法67“Indicators of microbial water quality”（Ashbolt NJ,et al）Definitions for indicator and index micro-organisms of public health concern2022/9/10卫生微生物研究与检测方法68目的以指示微生物在检品中存在与否以及数量的多少为依据，对照国家卫生标

33、准，对检品的饮用、食用或使用的安全性做出评价。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法69指示微生物分四种类型第一种类型的指示菌是为了评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数； (fecal indicator bacteria) 第二种类型是特指粪便污染的指标菌，主要指大肠菌群。其它还有肠球菌（粪链球菌）、亚硫酸盐还原梭菌（产气荚膜梭菌）等，它们的检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性；其他指示菌，包括某些特定环境不能检出的菌类；病毒（包括噬菌体）：间接反应肠道病毒存在的可能性。2022/9/10卫生微生物研究与检测方

34、法70一、指示微生物的选择总的选择原则；粪便污染指标菌的选择标准；为什么不直接检测致病微生物？2022/9/10卫生微生物研究与检测方法711、总的选择原则数量大，易于检出；检验方法比较简单、经济、方便；有一定的代表性：其数量变化能反映样品卫生状况和安全性。间接反映致病菌存在的可能性。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法722、粪便污染指标菌的选择标准是人及温血动物肠道正常菌群的组成部分，数量上占有优势； 在被人或动物粪便污染的样品中易检出，未彼粪便污染的样品中无此种菌存在； 排出体外后，在外环境中存活时间与肠道致病菌大致相似或稍长；如作为饮用水的指标菌，对氯的抵抗力应不低于肠道致病菌或

35、略强；排出体外后，在外环境中不会再繁殖；检验方法简便，易于检出和计数。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法73说明没有任何一个菌种能完全满足上述要求，但有少数细菌可以接近这些要求，如大肠菌群、粪大肠菌群。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法74为什么不直接检测致病微生物？从样品中直接检测目的病原微生物有一定难度在环境中病原微生物数量少、种类多生物学性状多种多样检验和鉴定方法比较复杂分离鉴定致病微生物需时较长分离鉴定致病微生物费用高，技术要求高致病微生物数量少，检测灵敏度受限，可能有假阴性直接进口的食品、饮用水要求直接检测致病菌，如：沙门菌、志贺菌、金葡菌、溶血性链球菌。2022/9

36、/10卫生微生物研究与检测方法75二、常用的指示微生物菌落总数概念：菌落总数是指被检样品的单位重量(g)、容积(ml)、表面积(cm2)或体积(m3)内，所含有的能在某种培养基上经一定条件培养后生成的菌落数量。卫生学意义：菌落总数是判定检样被微生物污染程度的指标，也是某些样品卫生限量标准。在饮用水、水源水、食品、药品、化妆品、物体表面、室内空气等，以及一些进出口贸易品中，都将细菌菌落总数作为卫生标准之一；霉菌和酵母菌菌落总数常是糕点、奶油等食品的卫生指标。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法76菌落总数的检验程序2022/9/10卫生微生物研究与检测方法77二、常用的指示微生物 粪便污染

37、指示菌-大肠菌群 概念：大肠菌群系指一群能在37、24h内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧革兰阴性无芽孢杆菌；大肠菌群包括了一群在生化和血清学反应上不很相同的细菌。符合这些条件的肠杆菌科细菌主要包括四个菌属：埃希菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希菌，也称大肠杆菌柠檬酸杆菌属，其代表种有弗劳地柠檬酸杆菌 克雷伯菌属，代表种为肺炎克雷伯菌肠杆菌属，代表种为阴沟肠杆菌和产气肠杆菌2022/9/10卫生微生物研究与检测方法78说明能在37生长的称为总大肠菌群，在44.5 仍能生长的称为耐热大肠菌群（粪大肠菌群）；耐热大肠菌群也包括肠杆菌科四个菌属的细菌，但主要是埃希菌属。202

38、2/9/10卫生微生物研究与检测方法79粪便污染指示菌-大肠菌群卫生学意义大肠菌群细菌主要来源于人、畜粪便，故将其作为粪便污染的指标菌用以评价检样的卫生质量，推断检样中有无被肠道致病菌污染的可能耐热大肠菌群主要是埃希菌属成员，更能代表样品被粪便污染的情况测定方法（实验课）多管发酵法滤膜法纸片法2022/9/10卫生微生物研究与检测方法802022/9/10卫生微生物研究与检测方法81二、常用的指示微生物 粪便污染指示菌-大肠杆菌 一开始就作为粪便污染指示菌（1893年）鉴定方法复杂，被大肠菌群替代（1973年）新的检测方法建立，重新作为指示菌检测（2000年）作为粪便污染指示菌意义最大（其次是

39、耐热大肠菌群，再次是总大肠菌群），如毒菠菜和毒黄瓜事件。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法82二、常用的指示微生物 粪便污染指示菌-粪链球菌 概念：肠球菌属中最常见的代表种，约占肠球菌分离株的30-70，是人及动物肠道中正常菌群，在自然界分布广泛，常存在于水、土壤、空气中。在人粪中所占数量少于大肠杆菌，在动物粪便中所占数量较高卫生学意义：粪大肠菌群/粪链球菌比值大于4.1，污染主要来自人粪比值小于0.7，污染主要来自动物粪介于二者之间，混合污染测定方法：多管法、平板表面涂布法、滤膜法2022/9/10卫生微生物研究与检测方法83二、常用的指示微生物粪便污染指示菌产气荚膜梭菌人和动物特别

40、是食草动物肠道内的常住菌。可被作为粪便污染的指标菌。特点是厌氧生长、能形成芽孢、能将亚硫酸盐还原为硫化物。对含氯消毒剂及外界不良环境有较强的抵抗力，在外环境中存活时间较长。如样品中大量检出而大肠菌群数量很少，表示粪便陈旧性污染。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法84三、其它指示微生物不得检出的致病菌致病菌概念的提出在我国主要是针对食品卫生检验而言，系指肠道致病菌和致病性球菌:沙门菌、志贺菌：常见食品卫生微生物检测指标金黄色葡萄球菌：中毒型食物中毒溶血性链球菌：空气污染、食品卫生指示菌绿脓杆菌：外科药、眼科用药、化妆品、游泳池水卫生指示菌破伤风梭菌：外用药品、根茎类植物为原料的药物控制检

41、出2022/9/10卫生微生物研究与检测方法85三、其它指示微生物肠道病毒的指示微生物作为理想的病毒指示物的条件是：检验方法简单；操作安全；抵抗力与肠道病毒相当或稍强；在被人粪肠道病毒污染的环境中存在，其存在数量应等于或大于肠道病毒数。尚无理想指示微生物用脊髓灰质炎病毒作为水质病毒指标 用细菌病毒噬菌体作为病毒指标2022/9/10卫生微生物研究与检测方法86第3章 卫生微生物研究与检测的方法 第3节 微生物定量计数与分型方法简介2022/9/10卫生微生物研究与检测方法87倾注平板计数法细菌、霉菌和酵母菌总数测定10倍梯度稀释、1ml加入平板、倾注培养基温度45 左右国标方法（GB/T478

42、9.2-2010）表面涂布计数法0.1ml不同稀释度样品于培养基上涂布加样量少，计数结果偏差较大不透明培养基也可；便于挑菌；避免热的培养基损伤。一、定量计数方法2022/9/10卫生微生物研究与检测方法88对样品中某种细菌进行选择性计数；又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。 最常用多管发酵法对水和食品大肠菌群计数；采用“多次稀释直至无菌”的方式进行。食品：3个10倍稀释度，各3管生活饮用水： 3个10倍稀释度，各5管水源水： 3个10倍稀释度，各5管据阳阴管数,查MPN表或计算MPN概率(95%可信度)。3、最可能数法（most prob

43、able number，MPN）2022/9/10卫生微生物研究与检测方法89显微镜直接计数法（Breed计数法）：不能区分活菌和死菌。比浊计数法：微菌落快速计数法：4、其它方法2022/9/10卫生微生物研究与检测方法90意义确定病原研究传染源、传播途径遗传多态性分析方法血清分型（玻片凝集 、试管凝集）噬菌体分型（伤寒、霍乱弧菌）细菌素分型耐药谱分型（稀释法MIC，标准纸片法）质粒图谱分型（指纹图谱、酶切图谱）毒素分型脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型。二、分型鉴定的方法2022/9/10卫生微生物研究与检测方法911、血清学分型用含有已知特异性抗体的免疫血清，与从样本中分离培养出的未知纯种

44、细菌进行血清学试验，以确定致病菌的种类或型别的技术；常用方法是玻片凝集试验。用接种环取待测培养物少量分别于抗血清及盐水中混匀，反复上下倾斜玻片，30S-30min即有结果。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法922、噬菌体分型噬菌体感染宿主菌具有严格的、稳定的宿主特异性；毒性噬菌体裂解宿主菌，在琼脂上会形成易于观察的噬菌斑；将同一细菌分成不同的噬菌体型。对未知菌的分型鉴定，一般应在生化和血清学鉴定基础上，再进一步进行噬菌体分型。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法932022/9/10卫生微生物研究与检测方法943、细菌素分型某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质；对某细菌素敏感的细菌，具

45、有该细菌素的受体，两者结合后，敏感菌被杀死；通过观察是否形成细菌斑而分型；可用某细菌素分型标准品或平板交叉划线分型。较血清学分型更细。利于追踪传染源、传播途径、病原学和流行病学研究。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法954、耐药谱分型通过进行细菌的药物敏感性试验实现细菌的耐药性分析；稀释法：用药物抑菌的最小浓度反映细菌的药物敏感性。标准纸片-琼脂法：国际推荐方法。以抑菌环直径(mm)表示待测菌对药物的敏感程度。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法965、质粒图谱分型分为质粒指纹图谱和质粒酶切图谱两类；基本过程包括：质粒提取-限制性内切酶酶切-琼脂糖凝胶电泳-结果观察；方法简单，用

46、途广：细菌性疾病流行病学调查、病原追踪等。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法976、毒素分型有些细菌会产生毒素，毒素是可溶性蛋白质，根据抗原性不同可将其分成不同的血清型。如金葡菌的肠毒素分为9个血清型。通过抗原抗体反应可测定不同类型的毒素，确诊食物中毒的病原和溯源调查。方法：基于抗原抗体沉淀反应的玻片法、基于标记抗原抗体反应的ELISA和胶体金纸片法。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法987、脉冲场凝胶电泳分子分型脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gel electophoresis, PFGE）分子分型是目前细菌分型 的最灵敏方法，已在识别特异菌、追溯食源性疾病暴发的

47、来源及关联性方面成功应用。不同菌珠的电泳图谱有高度特异性，分离、识别不同大小（45-1000kb）的限制性DNA片断，比较细菌基因组变异性况，即可识别特异菌珠。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法99PFGE发展美国国家CDC建立了分子分型网站-PulseNet，采用共享的PFGE分型技术和成果，进行全国范围的食源性疾病监控。方法复杂，应首先制备细菌全基因组DNA，然后进行类聚分析。赖于分子生物学技术发展。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法100六、其它分子生物学方法PCR；核酸杂交；GC含量测定；基因芯片；蛋白质芯片等。2022/9/10卫生微生物研究与检测方法1011、聚合酶链反应（PCR） 病原体的快速定性与定量检测或不易培养的微生物（人乳头瘤病毒、经性传播的衣原体、淋球菌、结核杆菌等）的检验。如1999年美国西尼罗病毒病原的诊断、PCR快速检测沙门氏菌（传统方法47d，PCR方法12h）等；特异、快速、敏感、简便、定量等，发展很快，如：禽流感病毒检测 （GB/T9483.1