复旦大学基因诊断与基金治疗教案07基因诊断的未来发展

1、第七章 基因诊断的未来发展未来的基因诊断将朝着三个主要方向发展：1 胚胎着床前诊断、2 母体外周血中胎儿细胞分析技术、3 对多发病、常见病进行准确的分析。一下就这三个方面分别详述。1 胚胎着床前诊断 胚胎着床前诊断即在囊胚8细胞期，通过对细胞的染色体核型分析和原位杂交，对胚胎进行诊断，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段。相关技术（1）聚合酶链反应(PCR)技术:1989年，通过PCR扩增了Y染色体位点特异序列，判定携带有X连锁隐性疾病双亲的子代胚胎性别。随着PCR技术的完善,巢式PCR、引物延伸预扩增PCR、荧光PCR等技术可以准确预测单基因疾病的胚胎着床前诊断（2）荧光原位杂交(fluor

2、escent in situ hybridization,FISH):是研究人类胚胎染色体异常的较好方法,它可以对染色体和DNA进行准确的研究,可以进行性判定、核型普查和染色体结构分析。此外,FISH可以对间期细胞核进行染色体计数,不需要象核型分析那样培养细胞或制备分裂中期细胞。采用单细胞快速制备中期染色体的方法,结合多种FISH技术,如多重杂交FISH技术、光谱核型分析、比较基因组杂交等，大大地提高了诊断的准确性和有效性。FISH依赖于荧光标记的探针,目前仅能获得绿、红、蓝3种可见的荧光色素,选择联合探针可以增加染色体的检测数目，同时检测多个染色体。胚胎着床前诊断常选择在囊胚8细胞期进行(胚

3、胎发育的第3天)，此时对胚胎的影响最小。超过8细胞期，胚胎细胞之间形成紧密联接,使活检操作比较困难。尽管胚胎着床前诊断已经成为辅助生殖的常规技术,但目前仍然不能对所有的遗传异常做出明确诊断。胚胎着床前诊断示例取8细胞囊胚期胚胎的1-2个细胞，进行FISH检测，并核型分析。胚胎着床前诊断的应用（1）筛检遗传异常的胚胎。（2）通过PCR进行单细胞检测的诊断，确诊遗传病囊性纤维化病是1992年Handyside采用PGD确诊的第一个遗传疾病,10年后囊性纤维化仍然是国外PGD发现最多的疾病。PGD已成功地应用于检测脊髓性肌萎缩。地中海贫血。家族性黑蒙性白痴。血友病。脆性X综合征。镰状细胞病。视网膜色

4、素炎。1-胰蛋白酶缺陷。马凡综合征。享廷顿舞蹈病。范可尼贫血。色素失调症等遗传性疾病。（3）对可能有遗传异常或高危遗传因素的病例进行检测。（4）可在生殖医学研究中对精子。卵子以及早期胚胎的发育过程提供有意义的信息胚胎着床前诊断展望胚胎着床前诊断技术目前已得到广泛应用，其必将成为重要的临床检测手段。随着人类基因组计划研究的进展、DNA诊断分析技术以及其他技术的不断发展，人们能够针对个别家庭的独特的染色体异位或已知的基因突变而设计探针，进行有效的诊断，采用荧光色素探针，对含有数百或数千标记物进行杂交，可以检测任何一条染色体缺失。易位。重复,以及数目异常等等。随着科技发展，应用胚胎着床前诊断早期确诊

5、多基因疾病，如肿瘤、糖尿病、冠心病也将成为可能。值得注意的是，胚胎着床前诊断仍应提高准确性和可靠性，从而达到更广泛的应用。2 母体外周血中胎儿细胞分析技术通过检测母体外周血中胎儿细胞而非通过羊膜穿刺或采集绒毛进行产前诊断，是一种非常有潜力的无创伤产前诊断方法人们很早就发现，胎儿的细胞可以进入母体循环中，在母体外周血中检测出来。孕妇外周血中胎儿细胞的检测是一种无创性的产前检测手段。近年来，随着分子生物学技术和胎儿细胞分离富集技术的发展，可以从孕妇外周血中得到一定比例的胎儿细胞应用于某些基因病诊断，也为其在法医学相关领域的应用提供了可能。孕妇外周血中的胎儿细胞早在十九世纪末，德国科学家就在死于子痫

6、的孕妇肺组织中发现过滋养细胞。随着胎儿特异性单克隆抗体的不断出现和细胞分离技术的发展，人们从孕妇外周血中主要发现了三种胎儿细胞： 滋养细胞（trophoblasts）：是胎儿早进入母体循环的细胞。 淋巴细胞（lymphocytes）：在母体外周血中出现较晚，但存活时间可长达分娩后6个月27年，下次妊娠时可再次出现，故不太适合于诊断或鉴定。 有核红细胞（nucleated red blood cell，NRBC）：有核红细胞在成人血循环中罕见，而在胎儿循环中普遍存在。它有独特的抗原成分，如转铁蛋白受体（CD71）、血型糖蛋白A（GPA）等，可被用来分离富集胎儿细胞。其存活寿命短，一般不超过90天

7、，不影响下次妊娠的诊断。因此，有核红细胞被认为是较适于诊断的胎儿细胞。孕妇外周血中胎儿细胞的富集富集（enrichment）技术是指从母体外周血中分离浓缩胎儿细胞的方法，富集母体外周血可以增加PCR对胎儿细胞的检出率。在实践中应用的富集方法主要有：密度梯度离心（density-gradient centrifugation）用聚蔗糖-泛影酸钠混合物作分离介质，加入孕妇外周血后离心，提出有核细胞层，其中包括胎儿有核细胞。流量细胞计数仪（flow cytometry）拣选：胎儿有核细胞可基于即细胞大小、细胞的颗粒程度、转铁蛋白受体和细胞表面糖蛋白分子4个参量被选择出来。现已普遍应用，并与荧光免疫染

8、色抗原标记等拣选方法联合应用。磁活化细胞拣选（magnetic activated cell sorting，MACS）：在细胞悬液中加入单核细胞抗体与靶细胞结合，再加入连接着IgG抗体的磁珠与单核细胞抗体结合，置于磁场下，便可聚集出靶细胞。电荷流式分离（charge flow separation，CFS）：CFS设备为一个水平槽，其中液体的梯度与电场方向相反。细胞垂直于液体梯度和电场流动，根据细胞表面电荷密度的特点，不同类型的细胞被彼此分离并集中，通过不同的管道进入收集管。孕妇外周血中胎儿细胞的检出在染色体水平检测胎儿细胞,主要是采用荧光原位杂交(fluorescence in situ

9、hybridization, FISH )的方法，诊断18三体、21三体、47，XXY等染色体病。技术步骤同本章前述胚胎着床前诊断。PCR技术在检测微量胎儿细胞进行基因诊断方面表现出很大的潜力。通过扩增母体外周血细胞的DNA，用PCR方法扩增胎儿特异性DNA片断，可检测到胎儿基因。PCR虽然不是细胞分离技术，但它能检测到母体血中极少量的胎儿DNA，在应用孕妇外周血进行胎儿遗传物质检测方面，是极其有价值的方法。3 对常见病、多发病进行准确的分子诊断对心血管系统疾病、糖尿病、精神疾病、乙型肝炎、神经系统疾病、恶性肿瘤、哮喘、近视眼等常见病和多发病，进行准确的分子诊断，是科学家长期以来的目标。由于许

10、多疾病发病原因不明，由遗传因素和环境因素共同作用所致，导致分子诊断不能够作为诊断指标，而处于辅助诊断的地位。随着科学的发展和对疾病病理的明确，对常见病、多发病的分子诊断将成为简便、迅捷的主要诊断方法。下面我们列举乙肝、肿瘤和原发性高血压的分子诊断方法。3.1 乙型肝炎病毒据统计约有75%的人类感染性疾病是由病毒引起的。有超过400种不同的病毒可感染人类，包括一些常见的病毒如乙型肝炎病毒、人类缺陷免疫病毒、人类乳头瘤病毒、疱疹病毒。虽有一些病毒的疫苗研制成功，但没有一种针对病毒的特效药。随着全球化的进程，病毒感染的地域界限越来越模糊，传播范围广、危害更大，如SARS等。因此，对病毒性疾病的快速早

11、期诊断显得尤为迫切和必要。分子诊断技术因其快速、简便、特异、敏感，对病毒的检测较其他传统方法有显著优势，在临床上得到广泛应用。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus HBV），简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，引起人类病毒性肝炎的主要病原体之一。慢性乙肝病毒能导致严重的肝脏疾病，最终可发展为肝硬化、肝癌。目前检测HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc等免疫学指标的方法已被临床广泛应用，为乙型肝炎的检测提供了一种简便快速的工具。但是，免疫学检测不能反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后等信息。而HBV的基因检测可为临床医生提供更多的信息，辅助HBV感染的诊断和治疗。分

12、子诊断方法：定量检测血液中HBV DNA可以采用靶分子扩增技术（PCR法），HBV的PCR检测采用的引物序列是依据其S、C、P、X基因中的高度保守序列来设计。在扩增时严格设置阴性和阳性对照，确保实验结果可靠。常用引物序列见下表：扩增位置引物序列扩增片段大小（bp）P、X基因特异片段5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-35-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3278C基因特异片段5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-35-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3477C基因特异片段5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACC

13、CCTATAA-35-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-32583.2 肿瘤肿瘤的发病机制至今未明，所以对大多数肿瘤，还缺乏相关的早期诊断技术。肿瘤发展过程中，有多种基因和蛋白质水平的改变，其特定的遗传变异与人类肿瘤发生发展的各个阶段相关。这种遗传变异作为对正常组织细胞的一种损伤性改变，是许多人类肿瘤形成最主要的内在因素。肿瘤是一种以基因异常表达为特点的疾病，基因表达模式改变，导致细胞生理特性的变化，如增殖、侵袭等。因此，特定肿瘤的基因表达标记，可用于肿瘤诊断、分型和对治疗反应性的预测。关注最多的基因是癌基因与抑癌基因。癌基因是一类能引起细胞恶性转化的基因，最初在逆

14、转录病毒基因组中发现，后发现许多动物正常细胞中存在与病毒癌基因相似的DNA序列，称为原癌基因（proto-oncogene）。在肿瘤发生中，原癌基因会转变为具有致癌作用的癌基因。按照编码蛋白的结构功能，癌基因可分为：1.生长因子类，2.酪氨酸激酶类，3.GTP结合蛋白类，4.核蛋白类，5.端粒酶类抑癌基因：一对等位基因由于其功能丧失，使得细胞过度生长增殖，导致肿瘤形成。这一对等位基因即为抑癌基因。常见的抑癌基因有：1.Rb基因，2.p53基因，3.APC基因，4.BRCA1基因，5.WT1基因，6.erbA基因，7.INK4基因等等早期分子诊断的策略通过分析一些原癌基因的点突变、插入突变、基因扩增和染色体易位、抑癌基因的丢失、突变和异常甲基化改变，可以辅助对恶性肿瘤的早期诊断。早期诊断中，选择含有患者肿瘤细胞来源基因信息的体液、分泌物、排泄物做为检测标本，并对其进行相关的处理，用分子检测技术对相关癌基因、抑癌基因进行定性、定量检测分析。3.3 原发性高血压原