RT–PCR的原理及实验步骤

1、RT PCR的原理及实验步骤一、RT PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互

2、补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的 HYPERLINK /subview/83218/83218.htm t _blank 转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在

3、目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为1530 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：4060，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去510度。c.3端要求：3端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3端最好选用A、G、C而尽可能避免

4、连续出现两个以上的T。d.引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。e.引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3端不应超过2个。f.同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。g.5端无严格限制：5末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。2. 耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡

5、处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。3. 试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。4、RNA的提取方法：RTPCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强

6、力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。三、RTPCR步骤：1、RNA的提取：2、cDNA的合成：逆转录体系的组成：3、PCR扩增：50ul PCR体系的组成：4、PCR反应条件：5、PCR条件的优化：PCR条件的优化主要是引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2 变化寻找最佳退火温度。此外Mg2浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2 mM左右。引物和模板的量等。6、产物的电泳和结果的测定：根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度），取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳4560min。成像系统成像分析。分离不同大小DNA