AB SCIEX新生儿-临床课件

1、AB SCIEX 串联质谱技术在临床检验中的应用李立军亚太区技术支持中心主要内容LC-MS/MS简介部分基础临床研究项目新生儿先天性代谢异常筛查维生素D测定45种氨基酸准确定量部分高级临床研究项目免疫抑制剂监测痕量睾丸酮测定痕量雌激素测定甲状腺素测定肾上腺素测定质谱能做什么目标化合物的定性、定量样品处理测试分析结果报告AB SCIEX 三重四级杆质谱定量分析的黄金标准Turbo V离子源气帘气离子传输Q1LINAC碰撞反应室Q3离子技术检测器LC-MS/MS串联质谱技术已经证明了它可以承担起检测新生儿遗传疾病的重任，少许新生儿的血样就可满足直接分析，减少假阳性的结果 串联质谱测试法主要是通过从

2、新生儿体内提取血液，通过特定仪器对血液分子进行分析，从而检测新生儿是否患病 一些成熟的临床研究项目先天性代谢异常Inborn Errors of Metabolism疾病生物标记物Biomarker of Diseases临床毒物学Clinical Toxicology治疗药物监测Therapeutic Drug Monitoring新生儿疾病筛查New Born Screening维生素D2/D3与类固醇Vit D2/D3 and Steroid Panel止痛药 Pain Panel Drugs 免疫抑制剂Immunosuppressant常见氨基酸分析Amino Acid Analysi

3、s内分泌紊乱Measuring Endocrine Analytes苯二氮平类Benzodiazepines 抗逆转录病毒药物Antiretroviral Drugs滥用药物筛查Drugs of Abuse Screening新生儿先天性代谢异常IEM（Inborn Errors of Metabolism）新生儿疾病筛查（Neonatal Screening）是指医疗保健机构在新生儿群体中，用快速、简便、敏感的检验方法，对一些危及儿童生命、危害儿童生长发育、导致儿童智能障碍的一些先天性疾病、遗传性疾病进行群体筛查，从而使患儿在临床上未出现疾病表现，而其体内生化、激素水平已有明显变化时就做出早

4、期诊断，结合有效治疗，避免患儿重要脏器出现不可逆的损害，保障儿童正常的体格发育和智能发育的系统服务。尤其对一些目前还无法在产前做出诊断的先天性疾病进行普查。根据40年来各国经验，只要能够建立一个完整有效的筛查系统，对个人、家庭和社会都可收到极好的效果，有显著的经济和社会效益。以苯丙酮尿症（PKU）为例，在国际上，日本人的PKU发病率最低，为1：80500，其成本效益比达1:2.5。根据计算，即使发病率为1:140000，其成本效益比仍达到1:1.7。中国的PKU发病率约为1:11000,经济效益应该更为可观1994年日本总结了开展筛查17年的费用，发现若不进行筛查，治疗和护理患儿的费用将是用于

5、全民筛查费用的4.2倍。新生儿疾病筛查测定常见氨基酸和乙酰肉碱基本原理样品处理LC-MS/MS干血点采样（DBS）测定氨基酸（AA）、乙酰肉碱（AC）含量根据统计结果辅助临床判断切取血点有机溶剂提取衍生化重新定容每个样品2小时FIA-MS/MS测定每个样品2分钟所需内标（二选一）CHROMSYSTEMS（www.chromsystems.de），P/N 55004Cambridge（），P/N NSK-A和NSK-B新生儿疾病筛查数据采集、处理的自动化流程数据自动化软件检测报告国内新筛的主要用户上海新华医院 API2000, API4000复旦大学附属儿科医院 API3200广州新筛中心（妇婴

6、医院）API3200武汉同济医院 API2000山东计划生育研究所API3200北京协和洛奇 API3000北京摩尔美康检验所 API3200北京爱普易 API2000北京八一儿童医院 API3200北京儿童医院 API2000沈阳盛京医院 3200QTRAP吉林大学附属第一医院 QTRAP5500广州金域医学检测 API3200广东省妇幼保健院检验科 API3200佛山市妇幼保健院 API3200广西柳州市妇幼保健院API3200广州市妇女儿童医疗中心 3200QTRAP深圳华大基因Qtrap5500吉林省中医药研究院，3200QTRAP云大医院 API3200深圳妇幼保健院API3200深

7、圳儿童医院API3200广西妇幼保健院API3200重庆儿童医院API3200 阴影线面积处是采血安全区（足跟内、外侧缘处，容易取得末梢血样）新筛采血注意事项用41度的湿软布热敷3-5分钟，使局部充血新筛采血注意事项用75%酒精棉签消毒采血部分，待酒精自然挥干或用消毒干棉球拭去留在足跟上的酒精新筛采血注意事项将取血部位皮肤绷紧 ，用一次性采血针刺入皮肤内3mm，使血液自行流出，用消毒干棉球拭去第一滴血，此后 流出的一大滴血珠。新筛采血注意事项收集后24小时邮寄4度可长时间保存新筛采血注意事项新生儿筛查所需的设备、试剂样品滤纸打孔器品牌不限可打3.2mm（或英寸）孔径恒温培养箱精宏电热恒温干燥箱

8、（上海）或binder BF-5396孔板振荡器江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司QB-9001或MH-296孔板离心机盐城市凯特仪器有限公司TD5A带96孔板转子或其他进口品牌移液枪(10微升，50微升 ，200微升 , 8道300微升)各一把品牌不限96孔板氮气吹干仪杭州奥盛MD200-1A96孔带过滤膜的双层微滤样品板密理博公司MultiScreen HV MAHVN4510超声清洗器 品牌不限漩涡振荡器 美国 Scientific Industries 多用途旋涡混合器Vortex.Genie2或Vortex.Genie2T40L氮气罐 当地供应商高纯氮气，需配置氮气瓶减压阀及连接气管化

9、学试剂甲醇4L,乙腈2L西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司色谱级或更好正丁醇500ml，乙酰氯100ml西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司色谱级或更好乙酸铵，甲酸西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司色谱级新筛用的同位素内标记物一般使用剑桥同位素的衍生化同位素内标，成本合大约15-30元/r人份，这个属于自配试剂，没有医疗器械许可证。如果使用拥有医疗器械许可证的试剂，那么有两种选择：PE 市场价约100元/人份 ；国产 山东英盛 市场价约80/人份。ESI/MS/MS花费液质临床常用检验项目单次最低收费（元）单次试剂耗材成本（元）单次检测时间(min)新生儿筛查（一次可检40多种代谢疾病）280-

10、35015-302min维生素D检测（25(OH)-D）200-30020-304 min类固醇等内分泌标记物检测50020-305 min移植科免疫抑制剂血药浓度快速测定200-30020-305 min维生素D测定维生素D是骨骼健康的重要指标最近的研究表明维生素D缺乏可能和其他一些身体状况相关：骨质疏松几种类型的癌症自身免疫性疾病心脏病糖尿病and more由于公众增加关注维生素D缺乏对于身体健康的影响，在过去的1-2年内，样品数量检测大大增加。目标分析物通常 是25-OH-Vit D2 and 25-OH-Vit D3维生素D测定维生素D的A-D-M-E及其与钙-磷平衡的关系Michae

11、l F. Holick, Resurrection of vitamin D deficiency and rickets, The Journal of Clinical Investigation Volume 116, Number 8, August 2006.维生素D测定基本原理样品处理LC-MS/MS血浆样本测定25-羟基维生素D2/D3简单液-液萃取离心重新定容每个样品30分钟LC-MS/MS测定每个样品4.5分钟所需试剂盒同位素内标：Medical Isotopes （/），P/N D2831 质控样、标准品：Chromsystems（），P/N 38033和0028维生素D测

12、定使用脱水离子作为母离子Control Level I 数据，AB SCIEX API 3200维生素D测定使用脱水离子作为母离子重现性表现AB SCIEX API 3200Vit D3重现性与准确度45种氨基酸的测定aTRAQ示例数据满足定量的严苛要求：线性范围11000M6次进样重现性0.84.9%（平均值2.2%），准确度95.4102.7%（平均值100.1%）45种氨基酸的测定亮氨酸、正亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸免疫抑制剂测定免疫抑制药物主要用于器官移植病人手术后的排异反应的抑制；主要特点用药窗口窄：低无效；高有毒；长期监测基本原理样品处理LC-MS/MS全血样本测定Cyclosp

13、orine A，Everolimus，Sirolimus，Tacrolimus四种免疫抑制药物简单蛋白沉淀离心每个样品10分钟LC-MS/MS测定每个样品2.55分钟试剂盒Chromsystems 6PLUS1免疫抑制剂测定示例数据部分免疫抑制药物免疫抑制剂器官移植患者临床用药窗口对重现性的要求优异的重现性，是用药安全性的保证限量值免疫抑制剂器官移植患者临床用药窗口对重现性的要求优异的重现性，是用药安全性的保证痕量睾酮的意义不同人群参考值PopulationLow (total)High (total)LOQ (pg/mL)ULQ (pg/mL)Prepubertal Children (0.

14、5- 9 year) 20 pg/mL500 pg/mL10-30 pg/mL5000 pg/mLFemale (Adult)150 pg/mL700 pg/mL10-30 pg/mL5000 pg/mLMale (Adult)2.60 ng/mL10 ng/mL-TIETZ Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics; 4th Edition用于性早熟的辅助研究青春期前的男童体内睾酮含量，是表征潜在性早熟风险的重要参数。此时，灵敏度的要求至关重要。痕量睾酮测定数据来源美国CDC睾酮测试标准化项目标准结果液质测定结果痕量睾酮

15、测定数据小结对灵敏度的特别要求仪器型号运行时间LLOQ线性范围重现性准确度日常测试API 3200 3 min 1 ng/mL 1-400 ng/mL8%5%痕量测试API 5500API 50005.5 min10 pg/mL 10-5000 pg/mL10%5%雌激素类的意义雌激素是一种女性激素相关的整类 ：Estrone 雌酮（E1） ，Estradiol 雌二醇（E2），Estriol 雌三醇（E3）；雌酮（E1）广泛存在整个身体。这是唯一在妇女绝经后依然能存在的雌激素；雌二醇（E2）是育龄妇女的主要的性激素，是维持女性特征和功能的雌激素。 另外，雌二醇对于妇女的骨骼健康是非常重要的激

16、素。雌二醇的失调会引起相关妇科疾病，甚至相关女性癌症；雌三醇（E3）的是由胎盘产生，只有在怀孕期间据有重要的意义。雌激素测定不同人群参考值PopulationEstrone (E1)Estradiol (E2)Estriol(E3)(Pregnancy)Adult Male10-65 pg/mL10-50 pg/mL 2ng/mLPremenopausal Female15-250 pg/mL20-750 pg/mL(Pregnancy)30-570 ng/mLPostmenopausal Female15-55 pg/mL10 pg/mL(non-pregnancy)2 ng/mLTarge

17、t LOQ5 pg/mL5 pg/mL 10 pg/mLULQ 500- 1000 pg/mL500- 1000 pg/mL2000 pg/mLTIETZ Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics; 4th EditionEstradiol: LC-MSMS test: 300K- 500K samples in US for one yearReference: Steroids 73 (2008) 1318-1321 ; Steroids 73 (2008) 1333-1338雌酮（E1）、雌二醇（E2）测定定量下限E

18、strone 5 pg/mL LLOQ, S/N=22Estradiol 5 pg/mL LLOQ, S/N=19 青春期前女童体内E2含量超过20pg/mL，是性早熟的危险信号。此时，灵敏度的要求至关重要。雌酮（E1）、雌二醇（E2）测定新的方法尿液样品衍生化法5pg/mL0.2ng/mL5pg/mL雌酮（E1）、雌二醇（E2）测定尿液样品衍生化法甲状腺素测定要点两种前处理方法，同一种液质方法，分别测定总T3/T4和游离T3/T4直接法测定游离T3/T4液-液萃取法提取总T3/T4甲状腺素测定示例数据，血清中添加1pg/mL游离T3/T4 MRM色谱图甲状腺素测定示例数据，总T3/T4和游离

19、T3/T4重现性和灵敏度TotalFree肾上腺素监测要点既是疾病标志物，又是治疗药物同时测定尿样、血样50 L 尿样或500 L血浆样品，SPE净化后进样测定范围血浆中10-4000 pg/mL尿样25-1000 ng/mLMetanephrineNormetanephrineMethoxymetanephrine肾上腺素监测示例数据，血浆中肾上腺素MRM色谱图MetanephrineNormetanephrineMethoxymetanephrine肾上腺素监测示例数据，定量数据Analyte%CV at Low QCAccuracy at Low QC (%)%CV at Mid QCA

20、ccuracy at Mid QC (%)%CV at High QCAccuracy at High QC (%)Metanephrine6.9097.22.8999.62.5199.4Normetanephrine8.901043.251004.05101Methoxymetanephrine6.451013.991003.69104Metanephrine10 4000 pg/mLr = 0.99821、iMethodTM测试法分析类固醇类物质 11种类固醇：硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）、脱氢表雄酮（DHEA）、氢化可的松、皮质酮、11-脱氧皮质甾醇、雄烯二酮、睾酮、17-羟基孕酮、孕酮、雌二醇、25-二羟维生素D32、iMethodTM测试法分