粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清TNF-α、IL8的影响

1、 硕士：蔡景融 导 师：武华教授4月粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清TNF-、IL8影响专 业：普通外科第1页研究方案研究基础研究计划及预算国内外研究进展选题依据 Content粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠血清TNF-、IL8影响第2页选题依据 溃疡性结肠炎(UC)是一个病因和患病机制还未完全说明，可能与微生态环境、黏膜免疫应答、应激、遗传等原因相关慢性肠道炎症性疾病，病变主要局限于结直肠粘膜及粘膜下层，可累及整个结肠甚至末端回肠。当前研究发觉，与健康人相比，UC患者肠道中微生物多样性降低约1/4，拟杆菌门与厚壁菌门在总菌群中所占百分比显著降低，而放线菌门与变形菌门百分比显著增加。肠道菌群是机体一个

2、特殊器官，其调整机体免疫、调控炎症、参加物质代谢等方面发挥主要作用。第3页 选 题依 据 粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT），是将健康人粪便中功效菌群移植到菌群分布异常患者胃肠道内，重建其健康菌群分布结构，实现肠道及肠道外疾病恢复一个治疗方式。现阶段，FMT研究大部分是关于FMT治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌感染（CDI）和炎症性肠病（IBD）个案或系列病例报道,但FMT造成患者肠道菌群详细发生何种有益改变及其潜在机制仍不完全清楚，但有待深入研究。对常规治疗失败或有手术禁忌证UC病人，FMT或许是不错选择。第4页 肠道菌群生理作用1.防御病原体侵犯

3、2.物质代谢作用3.生长与衰老4.合成维生素5.肠道生物、免疫屏障作用选 题依据 第5页传统升阶治疗方案，序贯地应用5-氨基水杨酸、糖皮质激素与免疫抑制剂，无疑最为安全易行、经济实用；然而无限期地等候疗效，可能错失治疗良机，延误缓解时间，使约50患者仍处于活动状态，造成失用或致残并发症，其疗效费用比反而降低。伴随新药问世后治疗经验积累，教授们提出早期、强力治疗，即降阶治疗方案。这种看似昂贵、危险，实则经济、高效治疗方法已使相当多IBD患者获益，但降阶治疗药品昂贵，又有一定风险，如严重感染、药品反应等，对非选择性病例也存在过分治疗之嫌，而且停药或减药后病情仍会发复发作，并表现出一定激素依赖性。对

4、常规治疗失败或有手术禁忌证UC病人，FMT或许是不错选择。当前FMT应用最为广泛是治疗复发性难治性难辨梭状芽胞杆菌感染(CDI)肠炎，其短期缓解率可达90以上。FMT也在其它各种疾病中被用于试验性治疗，都取得了良好效果，如IBD、IBS、肥胖、代谢综合征、糖尿病等。还有FMT被成功利用于系统性硬化病、帕金森病、慢性疲劳综合征和特发性血小板降低性紫癜等个案报道。 国内外研究进展第6页1检测指标及意义3试验方案2 创新之处及可行性分析4 研 究方案研究目标和内容第7页研究目标和内容1 溃疡性性结肠炎大鼠模型建模成功评判标准研究内容拟处理关键问题123研究目标粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠血清TNF-、

5、IL-8影响试验分组、建立溃疡性结肠炎大鼠模型粪菌液制备指标检测、 Chiu氏6级评分法评定损伤程度第8页（1）分组情况（2）模型建立 （3）粪菌液制备（4）指标检测（5） Chiu氏6级评分法评定损伤程度 （6）统计学分析2试验方案第9页2.1分组情况健康SD大鼠54只，雌雄各半，体重200-250g，由山西医科大学生理试验室提供。随机分成3组：空白对照组(A组)、模型对照组（B组）、粪菌液模型组（C组），每组18只。其中A组为正常大鼠，给予无菌生理盐水保留灌肠，天天一次，自由饮水、进食。B、C两组为溃疡性结肠炎模型大鼠，分别给予无菌生理盐水、粪菌液保留灌肠，天天一次，自由饮水、进食。（生理

6、盐水量、粪菌液量按体重换算）第10页2.2模型建立大鼠造模前1 d禁食24 h，不禁水，称重后，3戊巴比妥（1ml/kg）腹腔注射麻醉，52，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS W/V)按100 mg/kg加入等体积50%乙醇溶液；体位为头朝下，用聚丙烯管插入肛门上段8 cm，注射器注人。再倒立15 min左右，以防药液溢出，一次性灌肠。第11页2.3粪菌液制备粪菌液制备流程：将约5g供体（A组）新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入25 mL无菌09NaCl溶液进行初步均质加工；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤去除其中大颗粒物质；2 h内将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中深入匀质处理；浆体逐层经过直

7、径2浆体逐层经过直径20 mm、10 mm、05 mm和025 mm不锈钢滤网过滤以去除未吸收食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤样本以6000转/min速率离心15 min，并将沉淀再悬浮于09NaCl溶液中，得几乎无色无味粪菌液。取得新鲜粪菌液可马上进行移植，也可加入无菌甘油后置于一80作为冰冻样本保留18周。第12页2.4指标检测2.5Chiu氏6级评分法评定损伤程度 分别于造模后3d、7d、11d每组各取6只大鼠，3戊巴比妥钠麻醉后开腹，使用一次性采血针穿刺门静脉取全血2ml，待低温离心后，再吸出上清液，置于一80冰箱中保留备用，采取酶联免疫法（ELISA）测定血清TNF-、IL-8浓度。

8、取肛门以上8cm肠段卷起，置10中性甲醛中固定、石蜡包埋、切片、HE染色后显微镜下观察。而且于取材完成后采取颈椎脱臼法处死对应大鼠。2.6 统计学分析采取Spss13.0统计软件包进行分析，各组试验数据用均数标准差表示，血清学指标比较采取单原因方差分析，P0.05表示差异有统计学意义。第13页 3检测指标及意义TNF-主要由脂多糖(LPS)激活单核巨噬细胞产生，对免疫反应、机体代谢、炎症反应、抗肿瘤都有主要调整介导作用。1.溃疡性结肠炎中TNF-分泌水平及其mRNA表示高于正常组或未受累结直肠粘膜。2.TNF-不但能刺激巨噬细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和内皮细胞分泌花生四烯酸代谢物、

9、细胞因子和蛋白酶，还能吞噬细胞产物和补体片段引发细胞坏死、间质中蛋白质破坏和水肿发生，从而促进胃肠细胞组织损害。3.TNF-可使中性粒细胞聚集，内皮细胞粘附分子上调以及增加上皮紧密连接通透性和抑制上皮细胞生长等，还可诱导结肠上皮细胞凋亡，破坏肠粘膜屏障，同时血管系统也遭到破坏，经过以上路径造成一系列溃疡性结肠炎经典炎症病变。第14页IL-8 是一个强而有力中性粒细胞趋化和活化因子，由单核细胞、上皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞及T淋巴细胞在IL-1、TNF 和外源性因子细菌多糖(LPS)刺激下产生,其主要生物学作用是1.趋化并激活中性粒细胞,促进中性粒细胞溶酶体酶活性和吞噬作用,对嗜碱性粒细胞和T

10、 细胞也有一定趋化作用。 2.临床试验发觉IL-8 在UC 患者肠黏膜上皮中高表示而且IL-8 水平与结肠炎严重程度呈正相关。检测指标及意义3第15页技 术 路 线 图 SD大鼠空白对照组模型对照组血清TNF-、IL8浓度并取结直肠组织HE染色后光镜观察数据SPSS13.0统计软件分析粪菌液模型组3、7、11天各处死6只大鼠第16页可行性分析创新点 1导师对此项课题有系统、全方面认识与把握 2.已初步掌握动物喂养及试验操作基本要领3.山西医科大学试验中心具备本试验相关条件创新之处及可行性分析4现阶段，FMT研究大部分是关于FMT治疗复发性、难治性炎症性肠病（IBD）个案或系列病例报道,对常规治

11、疗失败或有手术禁忌证UC病人，FMT或许是不错选择，但其作用机制尚不完全清楚第17页研 究基 础前期研究工作积累（1） 导师武华教授有深厚学术造诣和丰富临床经验，可为试验提供理论技术指导。（2）已参阅大量与课题相关中英文文件及与本课题参考性较强相关资料和理论。硬件设施基本完备我校生理试验室具备完成本试验基本条件：高速冷冻离心机、均浆机、超低温冰箱、氮气操作厨、，能够满足本课题需求。动物中心试验室有喂养动物动物房和喂养条件。第18页预 期结 果 1.给予粪菌水UC大鼠与给予无菌生理盐水UC大鼠相比，血清TNF-、IL-8检测值较小，说明前者肠道炎症反应轻，通透性低，肠屏障功效相比后者很好。 2.

12、给予粪菌水UC大鼠与给予无菌生理盐水UC大鼠相比，结直肠损伤情况判定评分较低。第19页9月-3月4月-8月3月进 度安 排 文件查阅；资料搜集；资料分析；撰写汇报。 动物喂养，做好试验；搜集试验数据。整理资料；分析资料；统计分析；撰写论文。 第20页经费预算支出科目金额（万元）计算依据及理由累计0.8科研业务费0.25查阅资料、发表论文试验材料费0.5动物喂养、化学试剂及耗材0.05仪器设备使用费第21页参 考文 献主要参考文件：参考文件1邱新运,刘玉兰. 粪菌移植在疾病治疗中应用进展.中华内科杂志. , 2Borody TJ，Khomts AFecal microbiota transpla

13、ntation and emerging applicationJNat Rev Gastroenterol Hepatol，9：88-963 Ord6s I，Eckmann L，Talamini M，et a1Ulcerative colitisLancet，380(9853)：16061619 4 Frank DN，Robertson CE，Hamm cM，et a1Disease phenotype and genotype are associated with shifts in intestinalAssociated microbiota in inflammatory bowe

14、l diseasesJ. Inflamm Bowel is，17：179184 5 Borody TJ，Khoruts AFecal miembiota transplantation and emerging applicationsJNat Rev Gastroenteml Hepatol，9(2)：88-96 6 Round JL，Mazmanian SKThe gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and diseaseJNat Rev Immunol。，9(5)：313-323 7 苏献恩，于文

15、霞，王世宣中华内科杂志，1993：12：842. 8 Ishignro YMucosal proinflammatory cytokine production correlates with endoscopic activity of ulcerative colitisJ Gastroenter011 999；34：66ol.53 ,NO.11.第22页主要参考文件：参 考文 献 9Song AL. The severity correlation of TNF-, IL-6 and IL-8 levels in plasma in patients with ulcerative co

16、litis and their clinical significances J.China Prac Med, , 3(36): 3-4.10 Pearl DS, Shah K, Whittaker MA, et al. Cytokine mucosal expression in ulcerative colitis, the relationship between cytokine release and disease activity J. J Crohns Colitis, , 7(6): 481-489. 11 Eiseman B，Silen W，Bascom GS，et a1Fecal enema as an adjunct in the treatment of pseudomembranous enterocolitisJ.Surgery，1958，44：854-859 12 Feingold KR，Moser A，Patzek SM，et a1Infection decreases fatty acid oxidation and nuclea