大花惠兰、石斛兰的组织培养

1、大花惠兰、石斛兰的组织培养（1）材料与方法材料：大花蕙兰大花品种嫩芽。将母株放在温室内盆栽培养,于25 月陆续从母株上取8 cm 左右的新芽,剥去最外几层叶片,去芽的上半段，然后在超净工作台上采用三步灭菌处理法处理:先在70 %的酒精中处理6 s ,立即投入10 %的次氯酸钠溶液中10 min ,稍加摇动,取出后用无菌水冲洗,剥去外层23 枚叶片;再放入5 %的次氯酸钠溶液中5 min ,取出后无菌水冲洗,剥至最后1 枚叶片;再放入1 %的次氯酸钠溶液中1 min ,取出后无菌水冲洗数次。以上次氯酸钠溶液中均加入Tween20 以利杀菌剂更有效地发挥作用,在无菌条件下剥出约5 mm长地茎尖,以

2、生长点为中心,用解剖刀把茎尖切成4 个小方块,分别接入已经准备好的培养基上。培养基：原球球茎诱导导培养基基配方: MSS + 0. 5 mmg/ L BBA +1. 0 mmg/ L KKT + 2 g/ L 活活性炭（ HYPERLINK /active/ acttivee HYPERLINK /carbon/ carrbonn，AC）。原球球茎增殖殖培养基基配方为为:MSS + 0. 5 mmg/ L BBA + 0. 8 mg/ L22 ,442D +2 g/ L AAC,。幼苗苗分化及及生根养养基配方方为:MMS + KTT 1 mg/ L + NNAA 0. 5mgg/ LL +22

3、 g/ L AC。培培养条件件培养基ppH 55. 445. 8 ,琼脂脂粉0. 6 %00. 88 %,活性炭炭0. 2 %的,防防止褐变变,培养养室温度度2225,相对对湿度440 %,光照照12 h/ d ,光照强强度为22 0000 llx。结果观察察原球球茎诱导导：把茎尖尖切成的的小块,接入圆圆球茎诱诱导培养养基上，20天天后（或或更长时时间）观观察有无无圆球茎茎出现。结果调调查:圆圆球茎的的诱导率率= 产产生圆球球茎的茎茎尖数/ 接种种茎尖数数1000 %。原原球茎增增殖：将诱导导形成的的较大原原球茎块块切割成成直径338 mm左左右的小小块,接接种在圆圆球茎增增殖培养养基上。1

4、个个月后统统计增殖殖量，结果调调查:原原球茎增增殖率= 有新新原球茎茎的块数数/ 接接种块数数1000 %。幼幼苗分化化及生根根：将增殖殖的充分分成熟的的较大原原球茎块块切割成成直径338 mm的的小块,接种在在原球茎茎分化及及生根培培养基上上。455 d 后统计计分化率率、生根根率及根根系生长长状态。结果调调查:幼幼苗分化化率= 出芽数数/ 圆圆球茎个个数1000 %。幼苗生生根率= 生根根幼苗数数/ 幼幼苗数1000 %。 壮苗、驯化与与移栽：壮苗。1/2MSS，7 %琼脂, pHH 5.455.6，566周后植植株长出出粗壮的的根系。光照22 0000 llx；容器：23 cm30 cm

5、8 ccm四周周镂空的的塑料框框；将瓶苗苗从培养养室(恒恒温室)移至与与外界相相通的室室内放置置2 d后后,去瓶瓶盖炼苗苗3 - 7 d,洗洗净瓶苗苗根部的的培养基基,用110000倍甲基基托布津津或多菌菌灵浸泡泡组培苗苗根部,放置于于通风阴阴凉处晾晾干水分分至根系系发白变变软,即即可用于于移栽；基质。水苔和和谷(麦麦)壳22：河沙11：珍珠岩岩1（体积,是大花花蕙兰组组培苗假假植的理理想基质质；白天平平均温度度在200 以上,夜间温温度在115 左右。假植相相对湿度度控制在在80%以上。晴天上上午100: 000至下下午5: 000,作770%的的遮荫处处理，大花蕙蕙兰刚出出瓶的植植株很小小

6、、十分分脆弱, 放置置处要求求光照弱弱，种后用用喷雾器器将苗株株与植材材喷洒到到湿润为为止。每每天向叶叶片喷水水数次, 保持持湿润, 切忌忌过干或或过湿。10 天后才才逐渐增增加给水水量。良良好的浇浇水管理理措施、可大大大提高瓶瓶苗移栽栽成活率率。瓶苗苗移栽220 天天以后新新根长出出, 可可逐渐增增加光照照强度。每周进进行1 次根外外追肥，可用“花宝11 号”或“通用肥肥”20000 倍倍液喷洒洒。（3）讨论论在原球球茎增殖殖的继代代培养中中,200255 d 继代11 次较较为合适适,此时时产生的的原球茎茎未充分分成熟,增殖率率较高,且颜色色为鲜绿绿色;330 dd 以后后新生的的原球茎茎

7、充分成成熟,增增殖率会会有所降降低,颜颜色转为为深绿色色;原球球茎切割割块的大大小以直直径0. 5 cm为为适宜,过小易易死亡降降低增殖殖率,过过大增殖殖率也有有所降低低；在培养养基中加入22 g/ L AC活活性碳可可以有效效的降低低褐变率率；分化及及生根培培养时原原球茎切切割的块块越大分分化的越越早,幼幼苗长得得越壮;同一培培养基中中培养的的时间越越长分化化率越高高;分化化和生根根可以同同步进行行。（4）实例例大花花蕙兰杂杂交新品品种西维亚亚、玛利莲莲梦露、蒙米拉拉丝、女皇为材料料，把母株株放在温温室内盆盆栽培养养,于22 月底底4 月初陆陆续从母母株上取取8 ccm 左左右的新新芽,从从

8、基部切切离,用用自来水水冲洗,再用洗洗洁净溶溶液浸泡泡5 mmin ,自来来水冲洗洗10 minn ,剥剥去最外外几层叶叶片,并并剪去芽芽的上半半段. 然后在在超净工工作台上上采用33 步灭灭菌处理理法处理理:先在在70 %的酒酒精中处处理6 s ,立即投投入100 %次次氯酸钠钠溶液中中10 minn ,稍稍加摇动动,取出出后用无无菌水冲冲洗,剥剥去外层层233 片叶叶; 再再放入55 %的的次氯酸酸钠溶液液5miin ,取出后后无菌水水冲洗,剥至最最后一枚枚叶片;再放入入1 %的次氯氯酸钠溶溶液1 minn ,取取出后无无菌水冲冲洗数次次.以上上次氯酸酸钠溶液液中均加加入Twweenn -

9、 60 以利杀杀菌剂更更有效地地发挥作作用. 在无菌菌条件下下剥出约约5 mmm 长长的茎尖尖,以生生长点为为中心,用解剖剖刀把茎茎尖切成成4 个个小方块块,分别别接入已已准备好好的培养养基上.培养养条件：pH 5. 255. 66 ,蔗蔗糖2 % ,琼脂条条0. 6 %0. 855 % ,温度度2225,光照照强度22 0000 llx ,每日光光照122 h。培养基基配方：诱导原原球茎最最佳激素素配比为为KT 0. 05 mg/L ,NAAA 0. 5 mg/L，利于原原球茎增增殖的培培养基为为改良KKC + KTT 0. 055 mgg/L + NAAA 00. 55 mgg/L ,以半

10、固固体培养养,加香香蕉泥为为佳,增增殖率为为4. 1. 利于生生根壮苗苗的培养养基为改改良KCC + NAAA 0. 2 mg/L ,以固体体培养为为佳。讨论：灭菌处处理：大花蕙蕙兰属热热带气生生兰,靠靠根系附附着在林林中树木木及岩石石上生长长,多数数种类有有内生菌菌共生. 因此此外植体体灭菌采采用3 步处理理. 据据笔者经经验,大大花蕙兰兰外植体体灭菌比比其它植植物有一一定难度度. 我我们曾采采用抗生生素处理理,效果果不佳. 对于于供试品品种是否否由于存存在内生生菌而引引起外植植体灭菌菌处理困困难,以以及内生生菌在植植物体内内的分布布传播情情况有待待进一步步研究； 培养养基添加加香蕉泥泥：对

11、大花花蕙兰增增殖和分分化有明明显的促促进作用用,这与与香蕉泥泥中的有有机质和和天然激激素有关关,同时时能使培培养物在在适宜的的酸性条条件下生生长；原球茎茎切块细细小、稀稀疏的培培养瓶内内,群体体生长较较慢,而而切块较较大且密密集的瓶瓶内,生生长十分分健壮,表现类类似于群群体生长长效应. 因此此切割时时不可过过细,直直径要在在2 mmm 以以上,每每瓶可接接种300 多个个培养块块,可使使瓶内营营养得以以充分利利用；接种时时,采用用大罐头头瓶把培培养块11 次夹夹入或铲铲入,稍稍加晃动动半固体体培养基基即可使使培养块块分散开开来,既既节约时时间、成成本,又又降低了了污染率率； 用改改良KCC(无

12、机机盐减半半) 培培养大花花蕙兰,无机盐盐用量比比其它报报道用MMS 培培养基大大大减少少,增殖殖分化效效果均佳佳. 采采用降低低琼脂用用量制成成半固体体培养基基可简化化接种步步骤,而而且培养养块浸在在培养基基内,降降低了培培养块黄黄枯和切切口褐化化的机会会. 定定期摇动动培养瓶瓶,能使使培养瓶瓶内营养养得以充充分利用用. 无无机盐和和琼脂在在培养成成本中占占有很高高的比例例,采用用以上技技术可大大大节约约成本,利于大大规模生生产应用用；用自来来水代替替蒸馏水水,用绵绵白糖代代替蔗糖糖,用廉廉价的琼琼脂条代代替琼脂脂粉,降降低了成成本,效效果没有有丝毫降降低. 由于大大花蕙兰兰原球茎茎增殖不不

13、必用小小容器和和相对较较高的罐罐头瓶,可用透透光性好好的大容容器代替替； 采用用1 次次定植,不经移移栽,可可以减少少对幼苗苗根系的的损伤和和节约人人力. 只要保保证温室室内相对对湿度,对成活活率无显显著影响响,但组组培苗前前期生长长缓慢。石斛兰的的组织培培养石石斛兰为为兰科(Orcchiddaceeae)石斛属属(Deendrrobiium)植物物,为附附生兰,与卡特特兰(CCatttleyya)、蝴蝶蝶兰( Phaalaeenoppsiss) 、万代兰兰(Vaandaa)并列列为观赏赏价值最最高的“四大观观赏洋兰兰”。石斛属属是兰科科中仅次次于石豆豆兰属(B uulboophyylluum

14、 )的第二二大属,全世界界共有11 0000多个个原生种种,分布布区域广广,主要要在亚洲洲的热带带和太平平洋岛屿屿的东亚亚、东南南亚及澳澳大利亚亚等地区区。我国石斛斛属植物物共有774种22变种,主要分分布于秦秦岭以南南诸省区区,尤以以云南南南部最多多。石斛中中的铁皮皮石斛、金钗石石斛等是是名贵药药材，石解兰兰却是一一种观赏赏价值很很高的花花卉, 其花色色繁多艳艳丽、 花型型大、 花枝枝长、 花多多。 春石石斛节生生型主要要作为盆盆栽品种种, 秋秋石斛蝶蝶花型主主要作为为切花， 也可可以用来来进行造造型后盆盆栽。在繁殖殖上, 因为几几乎所有有的观赏赏类石解解都是杂杂种, 不能用用种子播播种得到

15、到大量与与亲代形形状一致致的植株株，分株和和高位芽芽扦插繁繁殖则速速度很慢慢，一般在在1年中的的繁殖速速度为22-3倍倍， 通过过茎尖组组织培养养技术产产生原球球茎，在原球球茎阶段段进行增增殖培养养和分化化，使原球球茎繁育育成小植植株，效效率很高高。石斛斛兰增殖殖的另一一途径就就是用通通过芽的的增殖方方式形成成再生植植株。1石石斛兰组培快快繁材料料与方法法材材料：选取生生长健壮壮的3-5cmm石斛兰兰新生芽芽，取茎茎尖为材材料，先先用自来来水冲洗洗干净，再用775的的酒精处处理8ss；后用用0.11升汞汞灭菌110miin，最最后用无无菌水冲冲洗4、5次，在无菌菌的环境境里在显显微镜下下剥取茎

16、茎尖组织织作为外外植体，接种于于无菌的的设计的的培养基基上。培养基基及培养条件件：芽的诱诱导。MsNAAA1.00mg/L66-BAA4.00mg/LKKT1.0mgg/L，pH55.0-5.44，温度度为2552，漫射射光（不不开日光光灯）。芽的增增殖和分分化。MsNAAA1.00mg/L66-BAA4.00mg/LKKT1.0mgg/L，pH55.0-5.44。壮苗生根根。1/22MsIBAA2.00mg/L 肌醇22.0mmg/LL水水解酪蛋蛋白1.0g/L+ 香蕉泥泥1.00g/LL 。移栽基质质。砖粒：木炭炭： 椰糠糠为4：1：11（体积积比）结果观观察芽芽的诱导导。将茎尖尖接于芽芽

17、的诱导导培养基基，经过400d的培培养，诱诱导出不不定芽。石斛兰兰为复茎茎性兰花花，较适适于用茎茎尖作为为其快速速繁殖的的外植体体。研究究表明，带1-2个叶叶原基的的茎圆锥锥成活率率高，不不易褐化化而致死死亡。 芽的的增殖培培养。将生长长至1-1.55cm 的不定定芽切下下，分别别转接于于芽的增增殖和分分化培养养基，30dd，芽芽增殖倍倍数为12倍倍。壮苗苗生根。选取生生长健壮壮、高22cm以以上的单单个芽体体接入壮壮苗生根根培养基基，60dd，生根根率达1100，且植植株根系系发达粗粗壮，形形成完整整的石斛斛兰小植植株。由由于根的的分化形形成，加加快了植植株对营营养的吸吸收，促促进了茎茎叶的

18、生生长，达达到了壮壮苗生根根的目的的。添加加一定量量的香蕉蕉泥有助助于石斛斛兰根系系的分化化。试管苗苗的移栽栽。当石斛斛兰试管管苗长55-7ccm高高， 有3片以上上真叶/ 时，就可进进行移栽栽。出瓶瓶前将瓶瓶苗移至至自然漫漫射光的的室内炼炼苗7dd，以增增强试管管苗对室室外环境境的适应应力，提提高其移移栽成活活率。移移栽前先先洗净试试管苗根根部培养养基，用用0.22甲基基托布津津溶液浸浸泡155minn，然后后移栽基基质中。小苗移移栽后应应浇透水水，放入入温室大大棚内，定根前前要控制制水分，只要保保持叶面面及基质质湿润即即可。石石斛兰较较适宜生生长的温温度为115-225，空气气相对湿湿度为

19、770-880。 讨论：春石斛用用芽增殖殖方式获获得再生生植株以春石斛斛盆苗的的茎段侧侧芽为材材料。剪剪取春石石斛的茎茎,剥离离叶片后后流水冲冲洗300 miin 以以上,770 %的酒精精浸数秒秒,用无无菌水冲冲洗1次次,再用用0. 1 %的升汞汞液浸88minn ,最最后用无无菌水冲冲洗8 次,获获得无菌菌外植体体。将经经过灭菌菌处理后后的春石石斛的茎茎在无菌菌培养皿皿内切成成222. 55 cmm的茎段段,每一一茎段上上有1 个茎节节。将此此茎段接接种在培培养基中中诱导侧侧芽生长长,培养养条件均均为:温温度(225 2),光照照为122 h/ d，光强116000Lx，诱导培培养基：MS

20、 + BBA0. 5 mg/ L + NNAA00. 11 mgg/ LL。90dd后诱导导出芽，转接至至MS + BBA0. 5 mg/ L + 22 ,44-D 00. 22 mgg/ LL促芽生长长，90dd长至约约2cmm，转接接于增殖殖培养基基MS + BBA 33. 00 mgg/ LL + NAAA 0. 2 mg/ L，30dd，增殖殖约2倍；铁皮石斛斛根尖诱诱导后用用芽增殖殖选择生长长健壮、根长为为3 ccm 左左右的铁铁皮石斛斛无菌苗苗, 用用刀片小小心切除除根冠后后, 取取长约00. 330. 5 cm 的根尖尖分生组组织平放放于培养养基中培培养。基基本培养养基为BB5，

21、入蔗糖糖30 g/L , 琼脂脂6.11 g/L , pHH 5.8。 培养养条件为为(2551), 光光照强度度为8000Lx, 持续光光照。诱导培培养基：B5+0. 5mgg/L224-DD+ 0. 5mmg/LLNAAA+ 3. 0mmg/LL6-BBA，出出愈率、类原球球茎形成成率、芽形成成率最好好。将类原原球茎转转接到BB5+ NNAA 0. 5mgg/L + 100% 椰椰子汁的的培养基基中进行行分化增殖殖培养, 类原原球茎逐逐渐变长长, 其其顶端分分生组织织先分化化出芽, 然后后叶原基基进一步步发育成成幼叶。稍后, 在其其基部出出现根原原基, 根原基基细胞分分裂延伸伸为根, 内部

22、部分化出出维管束束, 最最后形成成完整的的幼苗。同时，类原球球茎在分分化的同同时, 也会不不断增殖殖, 产产生许多多新的类类原球茎茎, 最最后逐渐渐形成丛丛生小芽芽。两种种不同途途径产生生的类原原球茎的的分化能能力有明明显不同同, 由由根尖直直接产生生的类原原球茎在在分化培培养基中中绝大多多数都能能分化成成小苗, 而由由愈伤组组织分化化而来的的类原球球茎分化化能力很很弱, 大多数数最终褐褐化死亡亡。根尖尖直接再再生芽:根尖, 除产产生一定定比例的的类原球球茎外, 还出出现根尖尖分生组组织直接接分化成成芽的现现象，适宜培培养基是是B5 (微微量元素素减为11/3 ) + 1% 芋头汁汁，但频频率

23、低；铁皮石斛斛丛生芽芽的增殖殖：将从日本本引进的的生长旺旺盛的铁铁皮石斛斛健康植植株,以以茎芽为为中心剪剪下,芽芽的上下下各留00. 55 cmm的茎段段,用洗洗衣粉浸浸泡200 miin左右右, 取取出后再再用自来来水反复复冲洗数数次,用用75%的酒精精溶液灭灭菌300 s,然后用用无菌水水冲洗11次,将将茎段腋腋芽的苞苞叶拨去去,然后后将0. 1%的HggCl22 溶液液倒入烧烧杯中灭灭菌100 miin,灭灭菌过程程中不断断摇动烧烧杯使灭灭菌更加加彻底,最后用用无菌水水冲洗556次次将HggCl22 溶液液冲净并并接种到到培养基基上。培培养条件件，温度222 ,光照照12 h/dd,光照

24、照强度为为2 0000 lx。铁皮石石斛丛生生芽的增增殖培养养基为MSNAAA0. 3 mmg/LL 6-BA55 mgg/L，一个芽芽30 d后芽增殖殖数可达155个。当当生长到到60 d时达达到铁皮皮石斛的的最高生生长点。将大小小达34 ccm的无无根苗切切割成单单苗，转转培养基基为MSS + 6-BA22 mgg/L+ 200%香蕉蕉汁，20 d左右右小苗的的茎节上上开始出出现根的的分化,接种330 dd后小苗苗长出浅浅绿色长长度0. 81 ccm、直直径0. 10. 2 ccm的小小根, 60 d后根根长度最最长可达达5 ccm以上上，生根率率95%，平均根根数4. 5条条。2实例铁皮

25、石石斛的愈愈伤组织织的诱导导铁铁皮石斛斛采自野野生。嫩嫩叶用自自来水冲冲洗干净净，先用775%的的乙醇对对铁皮石石斛嫩叶叶进行表表面消毒毒, 再再用0.1%的的HgCCl2 灭菌菌588minn, 用用无菌水水冲洗33次。将将已灭菌菌的石斛斛嫩叶, 在无无菌条件件下切成成3mmm2。培养养基为N66-BA11.0mgg/L蔗糖220 gg/L和和琼脂88 g/L, pH55.8，培养温温度255 , 日日光灯照照射, 光照强强度1 50002 0000 lx, 122 h /d。接种99 d后后,嫩叶叶开始出出现愈伤伤组织。紫皮石石斛兰其其原球茎茎的增殖殖和分化化材材料是紫皮石石斛兰的的种子无

26、无菌苗 ，将紫紫皮石斛斛兰无菌菌苗的原原球茎接接入增殖殖培养基基中，培养基基为MS，pH 5. 4 ,蔗糖220330 gg/ LL , 活性碳碳5 gg/ LL,琼脂脂7 gg/ LL 。温度224226 ,133 h/d,光光照强度度3 0000 lx。1 个个月后增增殖倍数为99. 55 倍。将增殖殖后的紫紫皮石斛斛兰原球球茎接种种于分化化培养基基上：6-BA 0. 2 mmg/ L + NAAA 11. 55 mgg/ LL ，40 d 后后调查分分化率，达到887.55%。将将分化的苗苗转入440g/ LMS 脱水培培养基（商店可可买）作作为生长长培养基基 ,11个月后后苗粗壮壮、根

27、系发发达、叶片紫紫绿,长长势比较较好。移栽栽，将组培培所得的的紫皮石石斛兰苗苗移入温温室,练练苗3 d 后后移栽。移栽前前先洗净净组培苗苗根部培培养基,用500 %的的多菌灵灵可湿性性粉剂11 0000 倍倍液浸泡泡10 minn ,然然后移入入苔藓基基质中,移栽成成活率为为32 %。广东石石斛的组组织培养养将将约3 cm长长且生长长健壮的的幼芽从从母株上上采下，自来水水冲洗11 h，去掉外外部叶片片，先用用75% 酒精精消毒330 ss，再用用0.11% 升升汞溶液液(加11 滴吐吐温)消消毒100 miin，无无菌水冲冲洗68次，用消毒毒滤纸吸吸干表面面水分，接种到到原球茎茎诱导培培养基：

28、1/22MS+6-BBA3.0 mmg/L+NNAA 0.55mg/L，蔗糖浓浓度3.0%，琼脂77.0 g/L，ppH 55.8。培养温温度(2262)，连续续光照112 hh/d，光光照强度为22 0000Lx。115 dd 左右右茎节处处开始膨膨大，330 dd 以后后逐渐有有绿色原原球茎长长出。将将获得的的原球茎茎转接丛丛生芽诱诱导及增增殖培养养基：花花宝1 号3 g/L+66-BAA 1.0 mmg/L+NNAA00.055 mgg/L+ 椰汁1100 g/L+ 活性炭炭(ACC) 00.5 g/L，蔗糖浓浓度3.0%，琼脂77.0 g/L，ppH 55.8，进行丛丛生芽诱诱导培养养

29、，培养环境境同上，20 d 时时由原球球茎上长长出绿色色丛生芽芽。将丛丛生芽再再次转入入新鲜丛丛生芽诱诱导及增增殖培养养基：即即花宝11 号33 gL-11+6-BA 1.00mg/L+NNAA00.055mg/L+ 椰汁1100 g/L+ 活性炭炭(ACC) 00.5 g/L中继继续培养养，300 d 为1 个继代代增殖周周期，增增殖倍数数可达55倍。将丛丛生芽接接到壮苗苗培养基基：1/2MSS+6-BA 0.55mg/L+NNAA 0.005mgg/L+ 椰汁1100 g/L+AAC 00.5 g/L，蔗蔗糖浓度度3.0%，琼脂脂7.00 g/L，ppH 55.8培培养丛生生芽逐渐渐长大成成苗。将将大约33 cmm长且生生长健壮壮的无根根苗切割割成单个个苗接入入生根培