代谢物酶法分析技术

1、 第五章 代谢物酶法分析技术第1页2代谢物酶法分析技术是指用酶法分析方法来测定人体內代谢物或代谢产物技术。 酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促反应底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性一类方法。 代谢物酶法分析技术概念第2页3 代谢物酶法分析 平衡法（终点法） 速率法（动力学法） 代谢物酶法分析理论基础1第3页4平衡法是指标本中待测物量有限，经过酶促反应逐步被消耗，当剩下底物量很小（1%5%）时，指示反应信号逐步到达平衡，即通常所说终点，所以又称为终点法(end-point method)。 平衡法特点是测定底物总改变量， 即测定是“浓度”。

2、平衡法基本理论(1)第4页5速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测定是速率（通常指是初速度），依据是当底物消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时反应速度（v）与代测物浓度成正百分比。速率法关键是怎样使酶促反应成一级反应。 速率法基本理论(2)第5页6在临床操作中，只要测定时间待测物消耗 Km2，这时酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物相关，呈一级反应动力学。 但在以NADH 或NADPH 为底物终点法测定中，因340 nm 吸光度限制，辅酶用量不可能过高。 第11页12在340 nm 处测定吸光度增加来进行定量方法乳酸测定双底物反应直接测定法 乳酸 +

3、 NAD+丙酮酸 + NADH + H+丙酮酸测定 在340 nm 处测定吸光度下降来进行定量方法 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+第12页13酶促反应底物或产物假如没有可直接检测成份，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而到达检测目标方法称酶促偶联法。 最惯用偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。 酶偶联法(2)第13页14脱氢酶指示系统 氧化型辅酶NAD(P)+在340 nm 处没有吸收峰, 还原型辅酶NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.第14页15脱氢酶指示系统 以脱氢酶为指示酶系统测定是氧化型辅酶(NAD+) 或氧化型辅酶(NA

4、DP+)变为还原型NAD(P)H后在340 nm 处吸光度增高来计算出被测物浓度，也可利用脱氢酶逆反应，将还原型NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处吸光度下降来计算被测物浓度。 第15页16脱氢酶指示系统 血清葡萄糖己糖激酶法测定 Glu + ATPG-6-P+ADPG-6-P + NADP+P-6-GA + NADPH + H+指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定340 nm吸光度上升速度与葡萄糖含量成正比 第16页17脱氢酶指示系统 血清尿素测定 尿素 + H2O2NH3 + CO2NH3 + -酮戊二酸 + NADH + H+谷氨酸 + H2O

5、 + NAD+测定340nm吸光度下降速度与尿素含量成正比，能够用速率法测定；也能够用平衡法测定 第17页18惯用试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及氨、钾、镁等离子酶法测定大多使用该指示系统。脱氢酶指示系统 第18页19过氧化物酶指示系统 共用指示反应最早由Trinder氏等人提出，被称为Trinder反应 最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目测定 第19页20过氧化物酶指示系统 血清总胆固醇氧化酶测定法 胆固醇酯 +

6、H2O胆固醇 + O2胆固醇 + 脂肪酸4-胆甾烯酮 + H2O2红色醌类化合物H2O2 + 4-AAP + 酚指示酶反应生成红色醌类化合物可在500 nm 处比色测定 第20页21化学名英文缩写最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585过氧化物酶指示系统 惯用Trinder反应生色基团 表内这些酚类衍生物，有是提升生色基团稳定性和溶解度、产物灵敏度和稳定性；有些生色基团产物是兰色醌类，能防止溶

7、血等色素干扰。 第21页22利用底物和辅酶重复反应，使待测物酶促反应产物不停扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物增加，提升了检测灵敏度，降低了共存物质干扰，到达高灵敏度和特异要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶( Ea 和Eb) 量。该法测定中所选择酶Km 值要小，方便用较少酶量保持所需灵敏度。 酶循环法(3)第22页23使用两种酶，即一个氧化酶用于靶物质氧化，一个脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生物)或靶物质氧化产物作为底物循环。检测指示系统： 循环前、后用速率法测定NADH(340 nm)

8、 改变。检测产物H2O2可经过Trinder 反应比色测定。产物循环氧化酶脱氢酶系统 第23页24产物循环氧化酶脱氢酶系统 甘油浓度测定 经过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在重复循环中G-3P 和DHAP 量不变，而产物H2O2 随每次循环不停递增，同时NADH 递减。在要求时间t 内，H2O2 累计量决定于t 和每min循环次数。 第24页25底物循环脱氢酶辅酶系统用一个脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+ 和NADH)。用395 nm 415 nm 波长测定反应中氧化型thio-NAD+ 转为还原型thio-NADH增加速度。循环反应条件： 酶对thio-NAD+

9、和NADH应有高度亲和力。溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。thio-NAD+ 和NADH 二者浓度和配比达最适条件。 第25页26底物循环脱氢酶辅酶系统血淸胆汁酸测定 胆汁酸与3-酮类固醇之间组成循环，不停产生硫代还原型辅酶（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。 第26页27氨循环合成酶脱氢酶系统 NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成NH4+进入循环再次生成NADH，在340nm测定。 第27页28酶循环法含有特点 灵敏度随反应时间延长而提升灵敏度随酶在扩

10、增反应中用量而提升利用酶对底物特异性,使测定系统简化利用四唑盐类显色反应可实现比色测定 第28页29酶活性恢复法 很多酶必需一些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性酶与标本混合，标本中无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活百分比能够反应这些无机离子、微量元素或辅酶含量。 其它酶法(4)第29页30异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 酶活性恢复法异柠檬酸+ NADP+-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离子，标本中Mg2+经过恢复ICD 活性，催化异柠

11、檬酸脱氢正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸光度増加。 第30页31酶活性恢复法应用举例丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子-半乳糖苷酶法测定钠离子淀粉酶法测定氯离子超氧化物歧化酶法测定铜离子碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等 第31页32激活和抑制法 有机磷是乙酰胆碱酯酶抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37水浴10min，测定剩下乙酰胆碱酯酶活性，被抑制乙酰胆碱酯酶活性能够计算出标本中有机磷含量。有机磷酶法测定依据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂含量。另有抑制ALP法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。返回章目录第32页33试剂酶质量试

12、剂酶概念 试剂酶特征 试剂酶纯度酶法设计要求 酶法设计共性要求 平衡法设计要求 速率法设计要求 代谢物酶法分析设计要求 3试剂酶起源第33页34试剂酶是指作为诊疗试剂来测定化合物浓度或酶活性一类酶。它是酶试剂关键，它质量是酶试剂质量决定性原因。试剂酶质量要求(1)试剂酶概念第34页35主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。 不一样起源同一个试剂酶有不一样理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性影响。 试剂酶起源和理化特征试剂酶质量要求(1)第35页36不一样酶试剂系统对试

13、剂酶纯度有不一样要求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。 纯度主要指标 酶比活性，酶比活性越高，酶纯度越高。杂酶含量，轻易引发副反应一些酶含量按 “允许程度”要求（见表5-2）。 试剂酶质量要求(1)试剂酶纯度要求第36页37表5-2惯用试剂酶理化特征及质量要求 名称起源分子量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性%（允许程度）葡萄糖氧化酶（GOD）A.nigerp.notatum186000154.3020蔗糖酶含量0.01%,过氧化氢酶10U/mg蛋白己糖激酶(HK)酵母1050004.50-4.80140磷酸葡萄糖异构酶0.01

14、%,G-6-P脱氢酶0.01%葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)酵母214.50140己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶0.02%过氧化物酶(POD)辣根402007.2050不含胺氧化酶及过氧化氢酶第37页38名称起源分子量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性%（允许程度）脲酶巨豆483 0004.905-100天冬氨酸酶0.02%,精氨酸酶0.002%,NH4+0.0005g/U,谷氨酸脱氢酶(GLDH)变形杆菌300 0004.6090醇脱氢酶、乳酶脱氢酶、苹果酸脱氢酶0.01%乳酸脱氢酶 心135 0004.5-4.8500丙氨酸转氨酶0.01%,丙酮酸激酶、醛缩酶0.001%脂蛋白

15、脂肪酶（LPL）心，假单胞菌属47 0005.950.05100ATP酶0.00008%, NADH氧化酶0.001%,胆固醇氧化酶0.002%,过氧化氢酶0.02%甘油激酶（GK)嗜热脂肪芽胞杆菌209 00085NADH氧化酶0.01%,己糖激酶0.02%第38页39名称起源分子量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性%（允许程度）磷酸-3-甘油氧化酶足球菌76 0004.60.140乳酸氧化酶0.001%胆固醇酯酶(CEH)假单胞菌3025ATP酶0.00008, NADH氧化酶0.001%,GOD0.00001%,尿酸酶0.00004%,过氧化氢酶1U/mg胆固醇氧化酶(CHOD)链

16、霉菌340005.1-5.425CEH0.005%,GOD0.00014%尿酸酶0.0004%胆红素氧化酶(BOD)疣胞漆斑菌54.100.2NADH氧化酶0.0007%尿酸酶肝1000006.3015过氧化氢酶1.0%丙酮酸氧化酶2600004.301.5ATP酶0.05% ，ALT、AST0.05%第39页40所用试剂酶特异性：怎样消除干扰原因：试剂中附加剂：怎样提升灵敏度：用PMS或黄递酶，将NADH上氢交给四氮唑盐，在可见光监测； 用酶循环法； 测定荧光法。酶法分析设计要求(2)酶法设计共性要求第40页41酶用量要足够大，能使反应1 min3 min 抵达平衡，以确保较快完成测定。反应要朝正反应方向进行，假如反应平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH 等方法,并设标准管一起抵达平衡以后测定。 Km 在确保测定线性前提下要尽可能小。平衡法设计要求第41页42所用酶 Km 应足够大，以确保测定线性和较长反应动态期。Km 太小，可加入竞争性抑制剂加大 Km。酶用量要适当，用少了可能造成线性期缩短，甚至一级反应丧失。普通认为酶用量比平衡法小。速率法酶促反应受很多原因影响