β-地中海贫血基因检测 pcr-反向点杂交法

1、-地中海贫血基因检测（PCR-反向点杂交法）第1页 -地中海贫血（简称-地贫）是一个因为-珠蛋白基因突变造成肽链表示失衡而产生单基因遗传血液病，多由-珠蛋白基因点突变所致，是我国南方各省最常见、危害最大遗传病之一。在中国人群中常见突变位点有CD41-42(-TCTT)、CDL7(AT)、IVS-654(CT)和TATAbox-28(AG)等位点。因本病多为点突变所致，故惯用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。第2页1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用【目】第3页PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reactio

2、n，PCR）是由美国PE Cetus企业Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立。这项技术可在试管内经数小时反应就将特定DNA片段扩增数百万倍，这种快速获取大量单一核酸片段技术在分子生物学研究中含有举足轻重意义，极大地推进了生命科学研究进展。它不但是DNA分析最惯用技术，而且在DNA重组与表示、基 因结构分析和功效检测中含有主要应用价值。第4页【原理】PCR技术原理DNA半保留复制是生物进化和传代主要路径。双链DNA在各种酶作用下能够变性解链成单链，在DNA聚合酶参加下，依据碱基互补配对标准复制成一样两分子挎贝。PCR技术基本原理类似于DNA天然复制过程，其特异性依赖

3、于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。第5页【原理】PCR技术原理PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成：模板DNA变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成双链DNA解离，使之成为单链，方便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；引物延伸：DNA模板-引物结合物在72、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新与模板DNA链互补链。第6页第7页第8页重复循环变性-退火-延

4、伸三过程,每一次循环使反应体系中DNA分子数增加约一倍,而且这种新DNA分子又可成为下次循环模板。理论上循环n次，就增加2n倍，即DNA分子数呈指数式增加。当经30次循环后，DNA产量达230拷贝，约为109拷贝。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。第9页反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提出一个斑点杂交技术，该技术采取固化了各种特异性探针膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中各种突变。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA方式，改变了传统杂交法一次只能检测一个突变模式，含有快速、简便、高敏感度和特异性强特点，

5、尤其在基因突变检测、基因分型、病原体检测等领域有其独特优势。 反向斑点杂交技术第10页反向斑点杂交采取生物素标识引物进行靶核酸扩增，将扩增产物同固定在尼龙膜上探针进行杂交，一次杂交反应能够检测各种靶序列。该方法含有快速、简便，高灵敏度和特异性特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，含有潜在临床应用价值。反向斑点杂交技术原理 第11页第12页【操作步骤】1.DNA获取（已准备好了） 2.PCR扩增（采取试剂盒） ：反应液管（做好记号）5000rpm，2秒加入 2ul DNA溶液总体积25微升反应体系各组分用量见理论课内容第13页PCR扩增条件50， 15m

6、in95， 10min94， 1min55， 30sec72， 30sec72， 7min35cycles反应条件按照试剂盒要求影响PCR原因见理论课内容第14页3.杂交 ：15ml管探针膜条（做好记号） A液 5-6mlDNA溶液（PCR产物）25ul沸水浴10min42杂交1.5小时以上第15页4.洗膜 ：50ml塑料管B液 40ml42 预热取出膜条，置于50ml塑料管中42 洗涤15min5.显色A液：POD=:1,轻摇保温30min,后用A液洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置显色液避光显色20min杂交反应条件按照试剂盒要求第16页结果判断41-42N654N-28N7

7、1-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5M41-42N654N-28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5M杂交膜条-28/N标本第17页41-42N654N-28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-

8、15MCAPIntMIVS-I-5M-28/ -28标本41-42N654N-28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5MIVS-II-654/ N标本第18页41-42N654N-28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5M41-42N654N-28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5M CD41-42/ N标本CD17/ N标本第19页41-42N654N-28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5MCD17/ IVS-II-654标本蓝色斑点为阳性杂交信号，所以N (+