大学《医学微生物学基础》期末复习重点、考点总结-第六章：抗细菌与病毒免疫、第七章：微生物学检查方法

1、抗细菌与病毒免疫 第一节 抗细菌免疫一、固有免疫 屏障结构 吞噬细胞 体液因素屏障结构 1皮肤与粘膜屏障 （1）机械性阻挡 （2）分泌杀菌物质 （3）正常菌群的拮抗作用 2. 血脑屏障 3. 胎盘屏障吞噬细胞 小吞噬细胞 外周血中的中性粒细胞大吞噬细胞 血中的单核细胞和各种组织中的巨噬细胞（单核吞噬细胞系统） 1 .吞噬和杀菌过程（1） 趋化、识别与结合： 细菌LPS、趋化因子、 IL-8、NAP-2、MIP等细胞因子吸引吞噬细胞穿过毛细血管壁聚集到感染部位。吞噬细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）通过识别结合病原体表面的病原相关分子模式（

2、pathogen associated molecular pattern, PAMP)而利于吞噬细胞捕获病原微生物，并可诱导促炎细胞因子的表达TLRs 包括细胞表面的（ TLRs1,2,4,5,6）和细胞内溶酶体、内体、内质网的TLRs（TLRs3,7,8,9）， TLRs识别后能增强吞噬和杀伤能力，促进细胞因子、趋化因子和抗微生物肽的分泌；调节APC成熟和T细胞分化，影响适应性免疫应答。甘露糖受体 识别结合细菌表面的甘露糖和岩藻糖残基清道夫受体 与细菌表面成分结合，清除血循环中的细菌（2）吞噬：直接吞噬 吞噬细胞的细胞膜内陷或伸出伪足将病原体包裹并摄入细胞质内。间接吞噬 Fc 或C3b介导

3、调理吞噬。（3）消化：吞噬体与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，在溶菌酶、髓过氧化物酶、防御素、活性氧中介物和活性氮中介物的作用下杀死细菌。蛋白酶、脂酶、多糖酶将菌进一步分解。2.吞噬细胞杀伤机制（1）氧依赖机制1 呼吸爆发：在吞噬作用激发下氧的代谢活跃，O2耗增加，分子氧在还原型辅酶的作用下生成活性氧中间物，包括O2-、1O2 、 H2O2 、HOCL和NH2CL等。这些物质有较强的杀菌作用。 2 过氧化氢-髓过氧化物酶-卤化物杀菌系统 髓过氧化物酶作用于H2O2和氯化物，使菌体蛋白卤化 而细菌死亡。3 一氧化氮系统 吞噬细胞活化后产生一氧化氮合酶，催化精氨酸产生NO，在氧分子存在下，生成NO2-、

4、NO3-，具有抗菌能力。（2）非氧依赖机制 溶酶体中的溶菌酶、防御素、乳铁蛋白、蛋白水解酶、酯酶、核酸酶等发挥杀菌作用。3.吞噬作用的结果完全吞噬不完全吞噬 T细胞分布于皮下和粘膜组织，识别感染细胞表达的热休克蛋白、脂类抗原-CD1复合物、某些病毒蛋白、磷酸化非肽分子等具有TH和CTL双重功能，对胞内菌和病毒感染发挥第一道防线作用。非特异性免疫分子补体 经典途径、替代途径和甘露糖结合凝集素途径三条途径激活C，形成膜攻击复合物导致细菌裂解。溶菌酶 主要来源于吞噬细胞，广泛存在于血清、泪液、唾液、乳汁和肠液，作用于G+肽聚糖。 防御素 破坏细胞膜裂解细菌。急性期蛋白 在IL-6和LPS的刺激下，肝

5、细胞合成脂多糖结合蛋白、甘露糖结合凝集素、C反应蛋白等，与细菌结合可促进吞噬或激活补体。还刺激炎性细胞因子引起炎症反应。二、适应性免疫抗胞外菌感染免疫 胞外菌 主要寄居在宿主细胞外的血液、淋巴液 和组织液中的病原菌，以产生内外毒素和引起炎症致病。1.黏膜免疫系统的作用 病原体与黏膜免疫系统中的M细胞结合被内吞，然后将病原体提呈给APC，在由APC将抗原提交淋巴细胞引起免疫应答，产生分泌型IgA。2. 抗体的作用 阻止细菌粘附 调理吞噬（调理素） 中和细菌外毒素（抗毒素） 抑制细菌对营养素的同化作用抗胞内菌感染免疫 胞内菌 主要寄居在细胞内的细菌。包括兼性胞内菌和专性胞内菌。感染特点 细胞内寄生

6、，低毒性、呈慢性感染过程，常有肉芽肿形成，多伴有迟发型超敏反应感染的免疫：T细胞为主的细胞免疫CD4 Th1细胞产生细胞因子，活化巨噬细胞、CTL、引起迟发型超敏反应CD8 CTL穿孔素、颗粒酶破坏感染的细胞，使细菌散出，再被抗体或补体的调理作用被吞噬细胞消灭。第二节 抗病毒免疫一、固有免疫1、干扰素（interferon,IFN）定义：由病毒或其他干扰素生剂诱导人或动物细胞产生的的糖蛋白，具有抗病毒等作用IFN诱生剂：病毒、细胞内繁殖的微生物、内毒素、原虫、人工合成的双链RNA等，其中以病毒和人工合成的双链RNA诱生能力最强。3.种 类： 种类产生细胞 抗病毒 抗肿瘤 免疫调节 人白细胞 强

7、 弱 弱 人成纤维细胞 强 弱 弱 T细胞 弱 强 强抗病毒特点： 抑制而不能杀灭病毒具有种属特异性对不同病毒的敏感性有差别4.抗病毒机制：病毒或IFN诱生剂作用于宿主细胞，激活IFN基因使IFN表达，IFN释放后作用于细胞IFN受体，经信号转导激活抗病毒蛋白基因，产生抗病毒蛋白而抑制mRNA转录或蛋白合成。2-5A合成酶途径 ： 在dsRNA存在条件下2-5A合成酶被活化，使ATP形成2-5A， 2-5A激活RNA酶L或F，切断病毒mRNA。蛋白激酶途径：在dsRNA存在条件下，PKR使蛋白质合成的启始因子 eIF-2 的亚基磷酸化，从而抑制病毒蛋白合成。NK细胞在感染早期（4 h）发挥作用

8、；不受MHC限制；不依赖于特异性抗体NK释放穿孔素、丝氨酸脂酶、细胞因子TNF等杀伤病毒感染细胞。被IFN激活后增强杀伤作用。二、适应性免疫体液免疫1 抗体对游离病毒的作用 中和抗体 改变病毒的表面构型或与吸附表位结合，阻止病毒吸附细胞； 与病毒形成复合物易于被吞噬和清除； 与无包膜病毒结合而被覆盖，阻止病毒脱壳 与有包膜病毒结合，激活补体使病毒裂解。2 抗体对感染细胞的作用 包膜病毒感染细胞后，细胞膜出现病毒抗原，抗体与之结合，在补体的参与下裂解细胞；调理作用促进吞噬细胞吞噬。 抗体与病毒感染细胞结合，通过ADCC作用被NK和巨噬细胞杀伤。细胞免疫 1.CTL的作用 释放穿孔素、丝氨酸脂酶和

9、高表达FasL杀伤病毒感染细胞。 2.Th1细胞的作用 活化的Th1细胞分泌IL-2 、 IFN、 TNF等，活化NK、CTL、巨噬细胞，增强杀伤能力； IFN可增强MHC、蛋白激酶、2-5A合成酶等抗病毒蛋白表达。免疫病理作用损伤宿主细胞超敏反应自身免疫性疾病第七章 微生物学检查方法 标本的采集和送检1 采集标本时应无菌操作2 采集病变明显部位或感染部位3 适宜时间与部位4 在抗生素用前取细菌标本5 检查血清IgG抗体应取双份血清6 尽快送检第一节 细菌感染的检查1. 细菌形态学检查显微镜放大法 普通光学显微镜、电子显微镜、暗视野显微镜等染色法 革兰染色法、抗酸染色法、单染色法以及特殊染色法

10、（如：荚膜、芽胞、鞭毛等）2.分离和鉴定（确诊的最可靠方法）鉴定的主要内容：培养特征形态特征生化反应 血清学鉴定毒力试验药物敏感试验3.病原菌抗原的检测（简便快速）4.核酸检测 PCR技术、核酸杂交、芯片技术等5.抗体检测概念 用已知抗原检测病人血清或其他体液中未知抗体及其量的变化，可作为感染性疾病的辅助诊断。适用范围 适用于抗原性强，以及病程较长的传染病诊断影响因素 很多，如早期应用抗菌药物及年老、体弱、免疫功能低下等。检查方法 直接凝集试验 肥达试验(伤寒、副伤寒)、外斐试验(立克次体)、显微凝集试验(钩端螺旋体)等 中和试验 抗O试验(链球菌性风湿病) 补体结合试验 诊断Q热柯克斯体 乳

11、胶凝集试验 流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌等 ELISA 广泛应用于细菌、病毒等多种病原体的微生物学诊断和流行病学调查第二节、病毒学检查一、标本的采集与送检基本原则与细菌的相似，但还要特别注意：对本身带有杂菌或易受污染的标本，分离培养时应使用抗生素。低温保存并尽快送检，因病毒在室温易失去活性。血清学诊断标本应采集发病初期和病后23w内各一份血清，观察其抗体的动态变化。二、病毒的分离与鉴定（金标准）病毒的分离 1. 动物接种 2. 鸡胚培养：按病毒种类接种不同部位 绒毛尿囊膜 天花病毒、痘苗病毒、HSV等 尿囊腔 流感病毒、腮腺炎病毒等 羊膜腔 流感病毒的初次培养 卵黄囊 某些嗜神经病毒3. 细胞培

12、养：病毒分离鉴定中最常用的方法。 按其生长方式分为单层培养和悬浮细胞培养 按来源、染色体特征及传代次数等分为原代细胞、二倍 体细胞和传代细胞系病毒在培养细胞中增殖的指标1.细胞的变化 细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）：有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变。 细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等； 邻近的细胞相互融合形成巨细胞(融合细胞)如：麻疹病毒、巨细胞病毒； 在培养细胞中形成胞质或核内包涵体，如狂犬病病毒、麻疹病毒2.红细胞吸附(hemadsorption, HAd) 具有血凝素的病毒（流感病毒等），使受染细胞膜含有病毒血凝素抗原成分，能与红细胞结合出现红细

13、胞吸附现象，以检测是否有病毒在细胞内增殖。3.干扰现象(interference) 某些病毒感染细胞时不出现CPE、Had等变化，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。4.细胞代谢的改变 培养液的PH改变 病毒的数量与感染性测定常用的方法：蚀斑测定法和50%组织细胞感染量（ID50或TCID50） 空斑形成单位（PFU）：可测定病毒数量，空斑（P1aque）是病毒在单层细胞中增殖并扩散而形成的不易着色的病灶区。一般是由一个感染性病毒体大量复制形成，类似细菌的菌落，称为空斑形成单位。病毒悬液中感染性病毒量以每毫升中的空斑形成单位数来表示。 50组织细胞感染量（TCID5

14、0） 是病毒毒力测定的方法，应用不同稀释度的病毒悬液接种动物、鸡胚或细胞培养，引起50发生病变或死亡的最小病毒量。可以估计病毒感染的强弱程度及含量。 新分离病毒的鉴定病毒核酸类型的测定 DNA病毒和RNA病毒理化形状的测定 包括病毒颗粒大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等形态学观察 通过电镜和免疫电镜检查血清学鉴定 病毒型别的最后鉴定须靠血清学方法基因测序和生化对比三、病毒感染的血清学诊断1.中和试验 病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验，可用来检查患者血清中抗体的消长情况，也可用来鉴定未知病毒或研究病毒的抗原结构。适用于人群免疫情况的调查。2. 补体结合试验 用已知

15、病毒可溶性补体抗原来检测病人血清中相应的补体抗体。3.血凝抑制试验 相应的抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的HA与红细胞的结合。常用于粘病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。4.凝胶免疫扩散试验 主要用于诊断HBV与乙型脑炎病毒等感染。四、病毒感染的快速诊断形态学检查 1.电镜和免疫电镜检查 2.普通光学显微镜检查病毒蛋白抗原检查 1.免疫荧光法 2.固相放射免疫测定（SPRIA） 3.酶免疫测定（EIA）特异性IgM抗体的检测检测病毒核酸 1.核酸杂交技术 斑点杂交、DNA印迹技术 2.核酸扩增技术 聚合酶链反应(polymerase chain reati

16、on,PCR)连接酶链反应(ligase chain reation,LCR)反转录PCR (RT-PCR) 3.基因芯片技术(gene chip)第四节 特异性预防与治疗 特异性防治是应用获得性免疫的原理，给机体注射或服用病原微生物抗原（包括类毒素）或特异性抗体以达到预防和治疗的目的。这种方法称为人工免疫(artifical immunization)。 人工免疫分为人工主动免疫和人工被动免疫。 人工主动免疫(artifical active immunization)：将疫苗及类毒素（抗原）接种于人体，使机体主动产生获得性免疫力。主要用于预防。 人工被动免疫(artifical passi

17、ve immunization)：输入含有特异性抗体的免疫血清、纯化免疫球蛋白抗体或细胞因子等免疫制剂，使机体立即获得特异性免疫力的过程一、人工主动免疫疫苗 1. 死疫苗(killed vaccine) 用物理或化学方法将其杀死病原微生物，但仍保持其抗原性的一种生物制剂。如霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗等。 2. 活疫苗(living vaccine) 通过毒力变异或人工选择发而获得的减毒或无毒株，或从自然界筛选得到的毒力弱毒或无毒株经培养后制成的疫苗亦称减毒疫苗(attenuated vaccine) 。如BCG、鼠疫、脊髓灰质炎等减毒活疫苗。死疫苗和活疫苗各有优缺点，见下表。 3. 新

18、型活疫苗 活疫苗与死疫苗的比较区别点活疫苗 死疫苗制品特点减毒或无毒的疫苗 死菌，仍保持免疫原性制备方法通过非正常培养减毒株通过物理化学方法使病原体失活接种次数1次 23次接种量量小 量大接种反应可在体内增殖，类似于在体内不增殖，可出现发热、全 轻型感染或隐性感染 身或局部肿痛等反应免疫的类型体液免疫和细胞免疫 体液免疫免疫效果较好，维持长(15年) 较差，维持短(0.51年)毒力回升有可能 不可能安全性对免疫缺陷者有危险 安全性好疫苗稳定性相对不稳定 相对稳定保存不宜保存，4存活2w，宜保存，4存活1年 真空冻干可长期保存生产和成本生产较复杂，成本高 生产简单，成本低 4.基因工程疫苗 利用

19、基因工程方法获得带有病原体保护性抗原表位的目的基因，将其导入原核或真核表达系统，表达该种保护性抗原，提纯后研制成疫苗。 5.重组载体疫苗 将编码某一蛋白抗原的基因转入减毒的病毒或细菌而制成的疫苗。 6.合成疫苗 根据病原体抗原的氨基酸序列合成的多肽作为疫苗。 7.亚单位疫苗 利用微生物的某种表面结构成分（抗原）制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，称为亚单位疫苗 。 8.DNA疫苗 9. 转基因植物疫苗 将编码某一病原体保护性抗原的基因转入植物并在植物中表达，当人们吃这些植物性食物的同时，完成一次预防接种。10. 治疗疫苗 以治疗为目的的一种新兴疫苗。 类毒素 细菌外毒素经0.3-0.4甲醛处理后，毒性消失而仍保持其免疫原性，即成类毒素。如DPT三联疫苗，可同时预防白喉、百日咳、破伤风三