分子生物学检验技术：第十三章 线粒体疾病的分子生物学检验

1、线粒体疾病的分子生物学检验Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders叶薇浙江省医学遗传学重点实验室线粒体（Mitochondrion）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College21. 动物细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天2. 每个细胞含几百到几千个线粒体3. 每个线粒体含2-10 线粒体DNA（mtDNA）线粒体的主要功能氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）电子传递链（electron transport cha

2、in）产能：ATP细胞凋亡（apoptosis） 自噬（autophagy）线粒体自噬（受损线粒体的清除）参与遗传：含有DNASchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College34合成ATP参与细胞凋亡5受损线粒体启动自噬School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College6线粒体功能涉及众多的组织器官School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College7参与遗传与疾病的发生School of Laboratory Medic

3、ine, Wenzhou Medical College8第一节 线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College9一、线粒体基因组及其表达系统人类有两种DNA：一种在细胞核里（23对染色体），一种在线粒体里。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College10母系遗传：在精子生成过程中，只保留极少数的线粒体提供精子运动的能量。不会，即使个别进入，精子中的线粒体DNA进入受精卵

4、很快分解。受精卵细胞核基因，一半来自精子，一半来自卵子，但线粒体基因则全部来自卵子“线粒体夏娃”理论和人类起源1987年发现线粒体夏娃。线粒体夏娃理论：现代人类的线粒体DNA均来自非洲的一位女性，她是人类各种族的共同祖先。11一、线粒体基因组及其表达系统School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College1213特点基因组小, 仅16569 bp双链环状DNA高突变率（一）人类线粒体基因组14 13 结构基因 22 tRNA 基因 2 rRNA 基因 12S rRNA 基因 16S rRNA 基因 非编码区 D-loop（约1120bp）

5、 L链复制起始区（约3050bp，tRNAAsn-tRNACys）（一）人类线粒体基因组7/43 0/4 1/11 3/13 2/13蛋白质编码线粒体/细胞核呼吸链（respiratory chain）复合物I:NADH DH II: SDH III: cyt c redIV: COXV: ATPase由5个复合物组成（二）线粒体基因组及其表达系统16密码子核基因组线粒体AUAIle起始UGA终止TrpAGA, AGGArg终止1、密码子（二）线粒体基因组及其表达系统线粒体DNA的复制： 1）半保留方式进行； 2）重链和轻链的复制不同步3）mtDNA的复制和核DNA的复制也不同步，参与mtDN

6、A复制的酶和复制所需要的调控因子均由核DNA编码。17（二）线粒体基因组及其表达系统转录： 对称性转录，重链按顺时针方向转录，轻链则以逆时针方向转录。转录后剪切位置常在tRNA处，成熟的mRNA仅在3末端加polyA尾巴，5末端不修饰帽子结构。翻译 ： 编码的13个多肽，均在线粒体内合成；合成系统与细菌中相似；合成体系中的其它因子（起始因子、延伸因子、释放因子、以及核糖体蛋白质等等）均在线粒体外合成；起始密码AUA编码的甲硫氨酸（Met），起始时需要甲酰化成甲酰Met 。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College18第一节 线粒

7、体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College19二、核基因组与线粒体基因组的相互作用School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College20核基因组编码了1500多个线粒体蛋白线粒体基因组只编码了13条多肽链“交叉对话（cross-talk）”机制第一节 线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病School of Labo

8、ratory Medicine, Wenzhou Medical College21线粒体疾病是复杂性疾病发生率： 1 / 8000遗传方式复杂常染色体隐性遗传（Autosomal Recessive）常染色体显性遗传（Autosomal Dominant）性连锁遗传（Sex linked）母系遗传（Maternally inherited）临床表型复杂累及多系统（Multisystemic involvement）影响几乎所有组织器官（Any organ or tissue can be affected） School of Laboratory Medicine, Wenzhou Med

9、ical College22线粒体疾病中常见的突变核基因突变（nuclear gene mutations）氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质, 例如: Surf1, SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc.呼吸链缺陷: 重复、缺失线粒体DNA点突变（mtDNA point mutations）碱基突变School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College23线粒体疾病中常见的突变mtDNA缺失/重复（mtDNA Deletions/duplications） eg. KSS, Pearson synd, diabetes & d

10、eafnessmtDNA拷贝数变异S. D. Taylor et al. Aging Cell (2014) 13, 293824母系遗传School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College25同质性突变与异质性突变School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College26线粒体基因同质性（Homoplasmy）0 或 100%异质性（Heteroplasmy） 0-100%核基因纯合子（Homozygous） 0 或 100%杂合子（Heterozygous）50%mtDNA同质性/

11、异质性突变与阈值School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College2728在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变MELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因）MERRF（肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维）： A8344G (80%), T8356C（在tRNALys基因）Leber视神经病（LHON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical Col

12、lege29在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变耳聋（Deafness）: A1555G, T1494C（在12S rRNA基因）A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）2型糖尿病（Type 2 Diabetes）: A3243G（在tRNALeu(UUR)基因） NARP（共济失调伴色素性视网膜炎神经病）：T8993G, T8993C（在ATPase 6 基因）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College30突变检测的方法变性高效液相色谱法（DHPLC）：点突变，异质性单链构象多态性（SSCP）限制酶指纹（REF）限制酶片

13、段长度多态性（RFLP）：点突变点杂交（dot blot）：点突变测序（Sequencing）：所有变异芯片（Chip） Technology：所有变异实时-PCR（Real-time PCR）：拷贝数长片段PCR（Long region PCR ）：缺失质谱（Mass Spectrometer）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College第二节 线粒体基因组与耳聋与耳聋相关的mtDNA突变点突变School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College3112S rRNA 基因C

14、1494T ，A1555G突变位点基 因同质性/异质性疾 病首次报道aT961delT+C(n)ins961insC12S rRNA同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Bacino et al.(1995)Tang et al.(2002)T1095C12S rRNA同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Thyagarajan et al. (2000)C1494T12S rRNA同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Zhao et al.(2004)A1555G12S rRNA同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal异质性综合征型耳聋

15、Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(UUR)异质性综合征型耳聋van den Ouweland, et al.(1992)G7444ACO1/ tRNASer(UCN)同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Pandya et al.(1999)A7445GCO1/ tRNASer(UCN)同质性/异质性非综合征型耳聋Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同质性/异质性综合征型耳聋Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同质性/异质性非综合征型耳聋Sue et al.(1999)T7512C

16、tRNASer(UCN)同质性/异质性综合征型耳聋Nakamura et al. (1995)A8344GtRNALys异质性综合征型耳聋Shoffner et al. (1990)G8363AtRNALys异质性综合征型耳聋Santorelli et al. (1996)T14709CtRNAGlu同质性综合征型耳聋Rigoli et al.(2001)G15927AtRNAThr同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Wang et al.(2008)第二节 线粒体基因组与耳聋耳聋相关的mtDNA突变的检测PCR-RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术基因芯片技术School of Labora

17、tory Medicine, Wenzhou Medical College33第二节 线粒体基因组与耳聋耳聋相关的mtDNA突变的检测PCR-RFLP技术34检测位点引物序列(53)退火温度() 产物长度(bp)A1555GC1494TCGA TCA ACC TCA CCA CCT CT58802TGG ACA ACC AGC TAT CAC CAA7445GACG CCA AAA TCC ATT TCA CT58987CGG GAA TTG CAT CTG TTT TTDNA测序35A1555GPark MK, et al. Int J Pediatr Otorhinolaryngol.

18、2014;78(11):1996-9.Partial sequence chromatograms of the mitochondrial 12S rRNA gene for a deaf patient carrying the A1555G mutation (A), and a normal hearing individual having a normal allele (B).Audiograms of some affected subjects.Pedigree of a six-generation Chinese Han family that harbors the 1

19、555A G mutation with aminoglycoside-induced and nonsyndronic hearing loss.Bai Y, et al. BMC Med Genet. 2010; 11: 129.Quantification of mtDNA 1555A G mutation load by pyrosequencing.Bai Y, et al. BMC Med Genet. 2010; 11: 129.第二节 线粒体基因组与耳聋耳聋相关的mtDNA突变的检测PCR-RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术金标准基因芯片技术School of Labor

20、atory Medicine, Wenzhou Medical College38基因芯片技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College39基因芯片技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College40第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变Leber遗传性视神经病变(LHON)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College411871年德国眼科医生Leber首先描述了一种主要发病于青少年男性的家族性视神

21、经病变。后来，该病以他的名字命名（Lebers hereditary optic neuropathy, LHON）。第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变Leber遗传性视神经病变(LHON)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College42线粒体遗传病急性或亚急性无痛性双眼视力下降好发于青年男性早期是视盘周围毛细血管扩张晚期为视神经萎缩Leber遗传性视神经病变(LHON)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College43诊断根据先证者的发病情况及体征，结合家族史

22、可明确诊断实验室检查：眼底检查和基因诊断Leber遗传性视神经病变(LHON)1988年，Douglas C.Wallace等，首次在一个LHON家族发现mtDNA复合物I的ND4亚基基因的一个点突变(G11778A)，开创了研究mtDNA与人类疾病的新领域。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College44第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变常用检测技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou M

23、edical College45突变位点基因同质性/异质性首次报道*G3316AND1同质性Saillard et al.(2000)T3394CND1同质性Hofmann et al.(1997)G3460A*ND1同质性/异质性Huoponen et al.(1991)C3497TND1同质性Kong et al.(2003）G3733AND1同质性/异质性Valentino et al.(2004)C4171AND1同质性/异质性Kim et al.(2002)T4216CND1同质性Torroni et al.(1994）A4435GtRNAMet同质性Herrnstadt et al

24、.（2002）G7444ACO同质性Huoponen et al.（1993）T10663CND同质性Brown et al.(1995)G11696AND4同质性/异质性Zhou et al.（2006）G11778A*ND4同质性/异质性Wallace et al.(1988)T12338CND4同质性Wong et al.（2002）G14459AND6同质性/异质性Jun et al.(1994)C14482G/AND6同质性/异质性Howell et al.(1998)T14484C*ND6同质性/异质性Johns et al.(1992)A14495GND6异质性Chinnery

25、et al.(2001)T14502CND6同质性Ozawa et al.（1991）C14568TND6同质性Wissinger et al.(1997)A14693GtRNAGlu同质性/异质性Tzen et al.（2003）A15951GtRNAThr同质性Li et al.（2006）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College46原发性突变：G3460A， G11778A，T14484C的突变，占全部LHON的 80-90继发性突变：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438

26、A ，G13708A ，G15257A新突变： A4435G 位于tRNAMet 基因可以调节ND4 G11778A 突变的外显率与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变原发性突变：G3460A， G11778A，T14484C的突变，占全部LHON的 80-90继发性突变：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438A ，G13708A ，G15257ASchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College47与Leber遗传性视神经病变相关

27、的mtDNA突变G11778A最常见；同质性/异质性突变频率：北美和欧洲约50-70%，中国90%左右G3460A携带该突变位点的LHON占所有病例的20%较高异质性T14484C该突变位点的遗传外显率27-80%School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College4849A4435G可以调节ND4 G11778A 突变的外显率tRNAMetSchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变L

28、eber病变相关的mtDNA突变常用检测技术PCR-RFLP技术PCR-SSCP技术DHPLC技术DNA测序技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College50PCR-SSCP技术SSCP：单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College51DNA测序技术School of Laboratory Medicine, Wenzh

29、ou Medical College52G3460AG11778AT14484C第四节 线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College53线粒体糖尿病美国糖尿病协会(1997)/世界卫生组织(1999)制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的13线粒体糖尿病是遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷，使ATP合成障碍、能量来源不足导致的一组异质性病变。School of Laboratory Med

30、icine, Wenzhou Medical College54Possible Metabolic Basis of Diabetes Mellitus55第四节 线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College56线粒体DNA突变与糖尿病突变位点累及基因同质性/异质性疾病首次报道C1310T12S rRNA同质性糖尿病临床表型Guan et al. (2010)A1438G12S rRNA同质性糖尿病临床表型Vawter et al.(2009)A3243G*

31、tRNA Leu (UUR)异质性糖尿病合并耳聋Van den et al.(1992)C3254AtRNA Leu (UUR)异质性妊娠糖尿病Ng et al. (2000)T3264CtRNA Leu (UUR)异质性糖尿病Matsuoka et al.(1997)T3271CtRNA Leu (UUR)异质性糖尿病Jaksch et al. (1995)G3316AMT-ND1同质性非胰岛素依赖性糖尿病Ogihara et al. (1995)T3394CMT-ND1同质性非胰岛素依赖性糖尿病Wallace et al. (1995)T3398CMT-ND1同质性糖尿病合并耳聋Jaksc

32、h et al. (1995)A3399TMT-ND1同质性妊娠糖尿病Ng et al.(2000)T4291CtRNA Ile同质性糖尿病临床表型Lifton et al. (2004)A4833GMT-ND2同质性非胰岛素依赖性糖尿病Onaya et al. (2000)A7472CtRNA Ser (UCN)同质性糖尿病合并耳聋Hanna et al. (2005)A8296GtRNA Lys同质性/异质性糖尿病合并耳聋Ohsawa et al. (1998)A10398GMT-ND3同质性2型糖尿病Kato et al. (2003)A12026GMT-ND4同质性糖尿病Onaya e

33、t al. (1998)C12258AtRNA Ser (AGY)异质性糖尿病合并耳聋Turnbull et al. (1998)T14709C*tRNA Glu同质性/异质性糖尿病合并耳聋Moraes et al. (1995)T16189CMT-DLOOP同质性2型糖尿病Poulton et al. (1998)Pathological mutations in tRNALeu(UUR)58tRNA参与蛋白质合成59第四节 线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断PCR技术DHPLC技术PCR-RFLP技术DNA测序技术School of Laborator

34、y Medicine, Wenzhou Medical College6061携带tRNA Leu(UUR) A3243G突变的糖尿病家系School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College62399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 为异质性突变RFLPDNA SequencingDHPLCControl A3243GA3242GWTSchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical CollegeDenaturing High Performance

35、 Liquid Chromatography (DHPLC)双链 DNA 片段大小寡核苷酸纯化和质控 突变检测RNA 分析和纯化基因分型 微生物鉴定 DNASep 柱是WAVE系统的“心脏” DNASep 柱的表面化学带正电的 三乙基铵(TEAA)与带负电的DNA 通过离子间的静电相互作用DHPLC 技术原理DHPLC三种工作模式 非变性条件部分变性条件完全变性条件School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College671、非变性条件工作温度: 50 C (大小依赖，序列不依赖)应用：双链DNA大小分析 (最大到 2000bp)微卫星不稳

36、定分析，杂合性缺失分析PCR 产物的检测和纯化结合多重PCR扩增对大片段的缺失和重复进行基因剂量分析School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College681、非变性条件：DNA 片段分离质粒 pUC18 由限制性内切酶 HaeIII切割，9个片段经WAVE 系统分离。在 0.8% 琼脂糖胶上， 257 和 267 bp 片段分离不开。 bp587458434298257+26717410280多重PCR - DHPLC 分析 RB1 基因样本DHPLC三种工作模式 2、部分变性条件工作温度 52-78 C (大小和序列依赖)应用：整个基因的突变筛查单核苷酸多态（SNP）发现 3、完全变