分子生物学检验：胚胎植入前的分子生物学检验

1、胚胎植入前的分子生物学检验胚胎植入1、前处理及排卵监测2、采卵3、卵子培养4、体外授精5、胚胎移植产前诊断技术是预防遗传病发生的主要途径先天性心脏病神经管畸形血红蛋白病、地中海贫血和镰状红细胞病唐氏综合征G6PD缺乏遗传性或部分遗传性出生缺陷绒毛膜取样技术 选择性流产-身心伤害、金钱、伦理-被动的不得已的方式？植入前遗传学诊断辅助生育技术与分子生物学的结合第一节：试管婴儿及植入前遗传学诊断的诞生PGD技术是由于辅助生育技术（assisted reproductive technique, ART）的成熟应用而产生的辅助生育技术（assisted reproductive technique,

2、ART）目前在我国，由于各种原因导致的不孕不育的数量正在逐年增长，ART应运而生人工授精（artificial insemination, AT）体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）.一、试管婴儿Robert G. Edwards, The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2010 As early as the 1950s, Edwards had the vision that IVF could be useful as a treatment for inf

3、ertility. He worked systematically to realize his goal, discovered important principles for human fertilization, and succeeded in accomplishing fertilization of human egg cells in test tubes (or more precisely, cell culture dishes). His efforts were finally crowned by success on 25 July, 1978, when

4、the worlds first test tube baby - Louise Brown was born. During the following years, Edwards and his co-workers refined IVF technology and shared it with colleagues around the world.试管婴儿第一代试管婴儿技术：体外受精-胚胎移植, 输卵管堵塞、子宫内膜异位症等引起的不孕症第二代试管婴儿技术：单精子胞浆内注射, 男性不育症患者第三代试管婴儿技术：胚胎植入前的遗传学诊断，解决遗传病及优生问题第四代试管婴儿技术：卵细胞核

5、移植技术，大龄患者; 未成熟卵的体外成熟技术，卵细胞发育障碍者二、植入前遗传学诊断的诞生PGD就是针对父母本身具有遗传学异常，其子代也有遗传学异常的高度风险，但不愿意在发现胎儿异常再进行选择性流产而发展起来的新辅助生殖技术，它结合了辅助生殖技术与遗传学诊断技术。它的应用可以说是从根本上解决了优生优育的问题，应用前景广植入前遗传学PGD：将精、卵体外受精，当胚胎发育到6-8个细胞时，取1-2个细胞进行遗传学分析，剔除具有遗传缺陷的胚胎，选择没有疾病表型、正常的胚胎植入母体子宫，阻断遗传病的发生 避免遗传病胎儿减少患者父母的痛苦降低手术并发症达到源头优生PGD发展史1965年Edwards最早提出

6、，1968年兔囊胚活检，取出少量滋养外胚层细胞分析染色体来选择雌性胚胎1989年，英国Handyside等对性连锁性疾病携带者实验体外受精后卵裂期胚胎活检，选择女性 胚胎植入，健康的女婴1994年，Monne用荧光原位杂交技术，染色体的非整倍体及性别PCR及相关技术，多色FISH，全基因组扩增以及基因芯片广泛应用第二节 胚胎植入前诊断的技术与方法PGD最早适用于性别诊断、某些单基因性遗传疾病、染色体结构和数目异常。近年PGD也可应用于对人类肿瘤易感基因的分析及一些迟发性疾病的基因检测。严格的适用人群和适应证：父母本身具有遗传学异常，其子代也有遗传学异常的高度风险（如X-连锁疾病的检测、常染色体

7、的隐性异常），但不愿意进行选择性流产染色体易位导致的反复自然流产者非整倍体性的体外受精者，尤其F 37 Y一、胚胎取材途径第一和第二极体活检卵裂球活检囊胚滋养层细胞活检（一）第一和第二极体活检极体是由卵母细胞减数产生的小的细胞，与卵母细胞相同的遗传物质优点：活检后卵子继续成熟与受精，不影响受精、胚胎的发育非胚胎操作，心理和伦理易接受取材早，分析时间较多缺点：无父方相关的基因组或染色体异常信息，不能确定性别不能提供受精后胚胎的染色体异常的信息（二）卵裂球活检最初的PGD进行性别鉴定，用于X-连锁疾病的检测 胚胎达6-8个细胞时，活检1-2个卵裂球优点：此阶段活检1-2个细胞不影响胚胎的进一步发育

8、，可检出来自父方的异常。目前最常用缺点：材料少，胚胎嵌合体发生率很高，漏诊和误诊（三）囊胚滋养层细胞活检取囊胚滋养层细胞进行PGD活检优点：囊胚期活检量多，提高PGD准确性，且不影响胚胎的发育潜能缺点：为滋养层细胞，存在多倍体现象，不能完全代表内细胞团二、常用的分子生物学技术单细胞PCR技术荧光原位杂交技术其他PGD技术（一）单细胞PCR技术单细胞PCR技术主要实验步骤模板制备单细胞基因扩增产物分析 1.模板制备模板核酸制备：冻融法、蛋白酶K/SDS消化法注意事项：DNA模板量极低，样本的采集和处理各个环节注意模板DNA的丢失和降解，DNA扩增失败或效率低，出现假阴性避免采样时的精子或其它细胞

9、的DNA污染,出现假阳性2.单细胞基因扩增单细胞DNA模板量极低，采用巢式PCR扩增，增加敏感性和特异性3.产物分析琼脂糖凝胶电泳，EB（Gel red）染色观察目的条带多态性分析等位基因寡核苷酸特异探针斑点杂交鸡反向斑点杂交单链构象多态性变性梯度凝胶电泳单细胞PCR技术的问题问题：模板少、扩增效率低、污染及等位基因脱扣(Allele Drop-Out, ADO)现象ADO:两个等位基因中只有一个被成功扩增的现象，为单细胞特有，只发生在杂合等位基因中，随意性解决方法：模板的充分变性优化PCR条件（首轮PCR）荧光PCR检测 （二）荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术应用：可以判断特定染色体的数目或

10、其存在和缺失的情况，中期染色体和间期核分析优点：简单、快速、灵敏度高和特异性强等优点适用范围：高龄育妇女、反复IVF失败、习惯性流产、男性不育（三）其他PGD技术植入前遗传学单倍型分析(preimplantation gentic haplotyping,PGH)非整倍体筛选(preimplantation gentic screening,PGS)1.植入前遗传学单倍型分析(PGH)植入前遗传学单倍型分析(PGH)应用：如X染色体长臂端粒区域Xq28集中了多种疾病的致病基因，包括血友病A、色素失调症和X-连锁的脑积水等，通过检测该区域的6个STR位点即可优点：范围广、技术的重复利用率高等优点注意：基因和STR位点之间可能有基因重组，同时分析疾病基因两侧的STR2.非整倍体筛选(PGS)借助于FISH技术，对高龄妇女、反复IVF种植失败以及反复自然流产妇女的胚胎进行非整倍体筛选，即胚胎进行染色体的非整倍体筛查，非针对遗传病基因，有助于提高IVF成功率15%的错误率，有一定的争议第三节：胚胎植入前诊断的应用评价PGD应用主要集中在以下类型：常染色体隐性遗传性疾病：b-地中海贫血.常染色体显性遗传性疾病：亨廷顿病.性连锁性疾病：X染色体综合征某些遗传病：乳腺癌一些迟发性