XXXX细胞工程教学提纲及补充思考题

1、细胞工程程教学提提纲、课后后思考题及及补充思考考题课程学时：36学时，学学分：2学学分教学基本要要求：1了解与与细胞工程程相关的重重要理论，背背景知识和和细胞工程程学的基础础知识。2了解和和掌握细胞胞工程各种种技术的基基本原理、技术和方方法。3了解和和掌握细胞胞工程的工工程与实验验技术。4了解细细胞工程重重要技术的的应用途径径和范围，存存在的问题题及缺点。5了解细细胞工程关关键技术的的最新进展展和发展前前景。 课程考核方方式：闭卷笔试综综合考查。平时考查查与期末考考试相结合合。1、平时出出勤、作业业成绩占110%；2、期中考考试成绩占占30%；3、期末考考试成绩占占60%。第一章绪绪论第1节

2、生物物工程1.1定定义1.2发发展历程1.3现现代生物工工程的特点点与组成一、定义1、利用生生物将原材材料转化为为产品的技技术。（KKail Erekky，19177）2、应用自自然科学及及工程学的的原理，依依靠微生物物、动物、植物体作作为反应器器将材料进进行加工以以提供产品品为社会服服务的技术术。（国际际合作及发发展组织，1982）3、以现代代生命科学学为基础，结结合先进的的工程技术术手段和其其他基础学学科的科学学原理，按按照预先的的设计改造造生物体或或加工生物物原料，为为人类生产产所需产品品或达到某某种目的的的技术。（国国家科委，1986）生物技术（biotechnology）以生命科学为

3、基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术，也就是利用生物有机体或其组成部分如细胞、组织、器官等发展新工艺或制造新产品的技术。二、发展历历程1、第一代代生物工程程（微生物物发酵，如如酒精等）2、近代生生物工程（医医用抗生素素、氨基酸酸、酶）3、现代生生物工程（高高新技术）三、现代生生物工程的的特点与组组成1、发酵工工程2、酶工程程3、蛋白质质工程4、基因工工程5、生物化化学工程6、细胞工工程第2节 细胞胞工程2.1定定义2.2发发展历史2.3主主要研究内内容2.4重重要应用一、定义细胞工工程（ceell eenginneeriing）应用细胞生生物学和分分子生物学学的

4、方法，通通过类似于于工程学的的步骤，在在细胞整体体水平或细细胞器水平平上，按照照人们的意意愿来改变变细胞内的的遗传物质质以获得新型型生物或特特种细胞产产品的一门门综合性科科学技术。二、发展历历史（略）三、主要研研究内容1、动植物物细胞与组组织培养2、细胞融融合3、染色体体工程4、胚胎工工程5、细胞遗遗传工程四、重要应应用1、优质植植物快速培培育与繁殖殖2、动物胚胚胎工程快快速繁殖优优良、濒危危品种3、利用动动植物细胞胞培养生产产活性产物物、药品4、新型动动植物品种种的培育5、供医学学器官修复复或移植的的组织工程程6、转基因因动植物的的生物反应应器工程7、珍稀动动植物资源源的保存与与保护8、应用

5、于于遗传学、发育学等等领域的理理论研究9、应用于于能源开发发、环保等等第一章小结结：定义一、生物工程发展历程现代生物工程的特点与组成定义二、细胞工程发展历史主要研究内容重要应用第二章细细胞工程基基础第1节 细胞胞生物学基基础1.1细细胞1.2染染色质与染染色体1.3细细胞周期1.4细细胞分裂1.5细细胞分化与与细胞全能能性细胞分化个体细细胞发育过过程中，后后代细胞在在形态结构构和生理功能能上发生差异异的过程。持家基因细胞中中维持细胞胞生存所必必需的基因因。组织专一基基因在各种种细胞中专专一选择表表达的基因因。发育潜能细胞分化能能力的强弱弱。高度分分化的植物物营养组织织具有全能能性，高等等动物细

6、胞胞发育潜能能变窄。细胞全能性性已经分分化和尚未未分化的细细胞所具有有的表达生物体体基因组任任何一种基基因、分化出任何何一种类型型细胞、各种种组织直至发育成成完整个体体的潜能。多能性随着胚胎胎的发育，细细胞具有分分化出各种种组织的潜潜能而失去发育育成完整个个体的潜能能，这种发发育潜能叫叫多能性。去分化在某些条条件下，分分化细胞不不稳定，基基因活动模模式发生可可逆变化又又回到未分分化状态的的过程，如如培养条件件下的植物物愈伤组织织。 一一个已分化化细胞，要要表现其全全能性，形形成完整个个体，首先先要经历脱分分化，然后后再经历再分化化过程。第2节 分子子生物学基基础2.1基基因与基因因复制2.2转

7、转基因技术术第3节 普通通生物学基基础3.1组组织、器官官3.2生生殖、发育育一、组织、器官分生组织织 植植物组织 成熟组组织 上皮组组织 动动物组织 结结缔组织 肌肉组组织 神经组组织分生组织按按在植物体体中的位置置分：（1）顶端端分生组织织（2）侧生生分生组织织（3）居间间分生组织织二、生殖、发育1、高等植植物的生殖殖和发育：花粉粒的形形成和发育育胚囊的形成成和发育开花与传传粉花粉萌发发和双受精精作用受精胚珠珠发育形成成种子（合合子发育成成胚，受精精极核发育育成胚乳）果实形成种子萌发与幼苗形成2、高等动动物的生殖殖和发育： 受受精卵卵裂球囊胚原肠胚形成中胚胚层胚层分化化幼体顶体反应获能的的

8、精子释放放顶体酶，溶溶解卵细胞胞周围的放放射冠和透透明带的变变化。精子必必须穿过几几层物理性性的屏障才才能穿入卵卵内。在哺哺乳动物中中，精子入入卵所面临临的第一层层屏障是一一层包埋在在黏性透明明质酸中的的卵丘细胞胞。精子头头部表面的的透明质酶酶活性有助助于精子穿穿过卵丘细细胞层。第第二层屏障障是在卵丘丘细胞层下下面包裹卵卵细胞的一一层透明带带。卵透明带是是被覆于卵卵母细胞及及着床前受受精卵外的的一层基质质，由糖蛋蛋白组成。在受精过过程中及早早期孕卵发发育方面具具有重要的的作用。当一个获能能的精子进进入一个次次级卵母细细胞的透明明带时，受受精过程即即开始。到到卵原核和和精原核的的染色体融融合在一

9、起起时，则标标志着受精精过程的完完成。受精的过程程包括精子子与卵子接接触、精子子穿过卵细细胞的放射射冠和透明明带、次级级卵母细胞胞进行第二二次分裂及及两性原核核的融合。 精子头部通通过顶体反反应释放顶顶体小泡中中的内容物物，有助于于精子穿过过透明带。透明带中中含有一种种特异性结结合的糖蛋蛋白受体ZZP3，而而精子头部部含有一种种能够和ZZP3结合合的黏附分分子1，4半乳糖糖基转移酶酶。当精子子与ZP33结合后，顶顶体通过胞胞吐作用将将内容物释释放。释放放的内容物物主要是一一些酶类，包包括N乙酰葡葡萄糖胺糖糖苷酶和顶顶体素，前前者用于降降解透明带带糖蛋白上上的寡糖链链，后者为为一种蛋白白酶。它们

10、们可以使精精子表面与与卵细胞质质膜结合的的蛋白暴露露出来。受受精素就是是其中的一一种，有两两个跨膜亚亚基组成，能能与卵细胞胞质膜上的的整联蛋白白受体结合合，从而引引发精子与与卵子融合合。胚层的分化化（1）外胚胚层 分分化成皮肤肤表皮和其其衍生物（比比如口腔、鼻腔、肛肛门的粘膜膜、毛发、指甲、爪爪等）、神神经系统、感觉器官官、肾上腺腺髓质等。（2）内胚胚层 分分化形成消消化道、呼呼吸道及排排泄管道的的上皮、肝肝、胰、扁扁桃体、甲甲状腺、胸胸腺等。（3）中胚胚层 分分化形成肌肌肉、骨骼骼、血管和和血液、淋淋巴系统、肾脏、生生殖腺、肠肠系膜等。 第二章小结结：一、细胞生生物学基础础（细胞、染色质与与

11、染色体、细胞周期期、细胞分分裂、细胞胞分化与细细胞全能性性）二、分子生生物学基础础（基因与与基因复制制、转基因因技术）三、普通生生物学基础础（组织与与器官、生生殖与发育育）第三章植植物组织与与细胞培养养第1节 植物物组织培养养与细胞培培养的区别别组织培养从生物物体内取出出组织或细细胞，模拟拟机体内生生理条件，在在体外进行行培养，使使之生存或或生长成组组织的技术术。植物组组织培养主主要是植物物无性脱毒毒快速繁殖殖技术。细胞培养使动植植物细胞在在体外条件件下存活或或生长的技技术，不再再形成组织织。植物细细胞培养主主要是以生生产植物次次生代谢产产物为目的的的大规模模细胞培养养技术。 第2节 发展历历

12、史（自学学）第3节节植物组组织与器官官培养3.1定定义与基本本原理3.2几几个重要概概念3.3细细胞分化和和形态建成成3.4植植物组培的的基本步骤骤3.5愈愈伤组织培培养3.6植植物器官培培养3.7植植物组培的的应用3.8人人工种子3.9植植物组织与与器官的生生物反应器器培养一、定义与与基本原理理 植植物组织培培养在无菌条件下下，将离体体的植物器官官、组织、细胞、胚胚胎、原生生质体等培培养在人工工配置的培培养基上，给给予适当的的培养条件件，诱发产生生愈伤组织织、潜伏芽芽，或者长长成新的完完整植株的的技术。理论依据：细胞全能能性科学研究表表明，处于于离体状态的的植物活细细胞，在一一定的营养养物质

13、、激素和其他外界界条件的作作用下，就就可能表现现出全能性性，发育成成完整的植植株。人工工条件下实实现的这一一过程，就就是植物组组织培养。 植物组组织培养技技术是一种种无性快速速繁殖技术术，与常规规营养繁殖殖方法相比比，只需少少量材料就就能获得大大量植株，可可以节约大大量种子、肥料、耕耕地，而且且是在人工工无菌操作作和控制生生长环境条条件下进行行，可进行行工业化生生产，对保保质、保纯纯和反季节节生产有着着特殊作用用，被认为为是农业高高新技术中中最重要、最活跃的的领域之一一，不仅是是农业继续续发展的基基础，而且且是生物技技术中应用用最广、最最具现实意意义的领域域，被誉为为农业发展展史上的第第四次绿

14、色色革命，对对解决经济济和社会发发展所面临临的人口增增长、农业业资源贫乏乏、环境污污染等重大大问题具有有十分重要要的战略意意义。二、几个重重要概念1、全能细细胞 能能够表达生物体体基因组的的任何一种种基因，并能能分化出该生生物体内任任一类型细细胞，进而而发育为一一个完全相相同生物体体的细胞。如合子（受精精卵）、早早期胚胎细细胞、顶端分生生组织细胞胞、成熟器官官遗留的胚胚性细胞等等。2、愈伤组组织 由由外植体组组织增生的的细胞产生生的一团不不定型的疏散排列列的薄壁细胞胞，比较容容易分离，通通常在外植植体伤口处产生生。这些细细胞的大小小、形状、液泡化程程度、胞质质含量、细细胞壁特性性等通常有有较大

15、差异异。继代培养养器官发生生再生植株株单细胞细胞培养养原生质体体3、外植体体 植植物组培中中用来进行行离体无菌菌培养的离体材料料，器官、组组织、细胞胞、原生质质体都可以以。4、继代培培养 愈愈伤组织在在培养基上上生长一段段时间后，营营养物枯竭竭，水分散散失，并已已经积累了了一些代谢谢产物，此此时将这些些组织转移移到新的培培养基上的的培养方式式，也称传传代培养。三、细胞分分化和形态态建成体细胞胚指离体体培养条件件下没有经经过受精过过程而形成成的胚胎类类似物，又又叫胚状体体。去分化在某些条条件下，分分化细胞不不稳定，基基因活动模模式发生可可逆变化又又回到未分分化状态的的过程，如如培养条件件下的植物

16、物愈伤组织织。 一一个已分化化细胞，要要表现其全全能性，形形成完整植植株，首先先要经历脱分分化，然后后再经历再分化化过程。组培研研究结果表表明：分化化细胞的脱脱分化关键键需要两个个条件：创伤和外源激素素，如生长长素、细胞胞分裂素或或赤霉素。植物组织培培养常用仪仪器设备：电子天天平、高压压蒸汽灭菌菌锅、电热热干燥箱、超净台、冰箱、人人工气候培培养箱、人人工气候室室、三重纯纯水蒸馏器器、超纯水水仪、电炉炉、试管、三角瓶、培养皿、剂量器皿皿（量筒、容量瓶、移液管、移液枪等等）、烧杯杯、试剂瓶瓶、镊子、解剖剪、解剖刀等等。植物组织培培养培养基基成分：培养基基应含有植植物生长所所必需的各各种营养成成分，

17、以满满足植物正正常生长发发育的需要要。在完整整的全培养养基中应包包括无机盐盐类、碳源、有机氮源源、植物生长长激素、维生素等物物质。这些些物质主要要有四个方方面的生理理作用：一一、作为结结构物质参参与机体的的建构，如如蔗糖提供供碳源，肌肌醇在糖类类的相互转转化中起作作用，是构构成细胞壁壁的材料，也也参与细胞胞膜的构建建。氨基酸酸是很好的的有机氮源源，可直接接被细胞吸吸收利用；二、构成成特殊的生生理活性物物质，在代代谢中起调调节作用，如如维生素类类物质在植植物细胞中中主要以各各种辅酶的的形式参与与多种代谢谢活动，对对生长有促促进作用；三、维持持离子浓度度的平衡、电荷荷平衡、胶胶体平衡等等，如琼脂脂

18、作为培养养组织的支支撑物起支支持作用；四、影响响器官的形形态发生和和建成，如如钾、铁、镁、钙等等 。植物组织培培养培养基基成分：（1）无机机盐类大量元元素：N、S、P、K、Ca、Mg等微量元元素：Fee、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo等通常无无机盐浓度度为25mmmol/L左右，硝硝酸盐浓度度一般为22540mmmol/LL，其中必必须添加钾钾元素，浓浓度在200mmoll/L或更更高，磷、镁、钙、硫元素浓浓度在13mmool/L。（2）碳源源最常采采用的碳源源为蔗糖，用量量在2%3%范围内内。 （3）有机机氮源通常采采用的有机机氮源有蛋蛋白质水解解产物、谷氨酰胺胺或氨基酸酸混合物。（4）植

19、物物生长激素素（用量常常在0.111mg/L）生长素素能促进细细胞分裂，促促使根的形形成，最常常用的有吲吲哚乙酸（IAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）。吲哚乙酸是一种吲哚类具有生长素活性的广谱性植物生长调节剂，目前主要用于植物组织培养、诱导愈伤组织形成、促进生根。吲哚丁酸主要应用于促进插条生根。萘乙酸促进植物生长、插条生根。2，4-D用途随浓度而异，效果不一，在较低浓度下是植物组织培养的成分之一，促进愈伤组织的形成。细胞分裂素素通常是腺腺嘌呤衍生生物：6-苄基嘌呤呤（BA）、玉玉米素（ZZT）、激激动素（KKT）。6-BBA是诱导导芽的分化化，促进

20、侧侧芽萌发生生长，促进进细胞分裂裂与扩大抑抑制根的分分化。 （5）维生生素维生素素作为植物物细胞分裂裂、分化的的生理活性性物质，在在植物细胞胞内主要以以各种辅酶酶的形式参参与多种代代谢活动。常用的维维生素有：盐酸硫胺胺素（维生生素B1)、烟酸（维生生素B3）、盐盐酸吡哆素素（维生素素B6）、抗抗坏血酸（维生素C）。一般采用的维生素浓度为0.11mg/L。 （6）肌醇醇又叫环环已六醇，可可促进愈伤伤组织的生生长和胚状状体及芽的的形成。常常用浓度为为50100mmg/L。（7）复合合物通常为为细胞生长长调节剂，包包括酵母抽抽提液、麦麦芽抽提液液、椰子汁汁和水果汁汁等。一些些抽提液对对细胞有毒毒性，

21、现在在已被已知知成分的营营养物质代代替。目前前仍广泛使使用的是椰椰子汁。组培常常用基本培培养基是MS培养基基，另外还还有B5、N6、NT、AA等培养养基。调ppH5.555.8。培养基及器器械的消毒毒：玻璃培培养仪器及及无菌操作作所用的水水、滤纸、纱布、各各种器械如如解剖刀、解剖剪、解剖针、镊子等通通常与培养养基一起事事先用高压压灭菌锅灭灭菌备用。四、植物组组培的基本本步骤1、培养材材料的采集集2、材料消消毒3、制备外外植体4、接种和和培养5、诱导生生根6、炼苗、移栽1、培养材材料的采集集理论上上全能植物物细胞有3类：（1）受精精卵（2）根尖尖、茎尖、叶、花等等分生组织织细胞（3）雌雄雄配子及

22、单单倍体细胞胞，如花药药、花粉粒粒等在快速速繁殖应用用中，通常常用茎尖，一般般切0.55cm左右右；如果想想要脱毒苗苗，通常只只切茎尖0.11mm以内内的部分，因因为茎尖分分生组织没没有分化出出维管组织织，病毒难难以感染到到这个部位位，但一般般说来，外外植体越小小，培养难难度越大。2、培养材材料的消毒毒材料先先用自来水水冲洗干净净用蒸馏水冲洗洗（以下在在超净台上进进行无菌操操作）无菌水冲洗洗无菌滤纸纸吸干水已消毒解解剖刀切成小块70%酒精精浸泡30060s移入漂白粉粉饱和液或或0.011%升汞（HggCl2）消消毒10mmin左右右无菌水冲洗洗无菌滤纸纸吸干水常用消毒剂剂效果的比比较植物组织培

23、培养中常遇遇到的问题题污染染污染连连同褐变、玻璃化被被称为植物物组培三大大难题。1、污染的的原因（1）外植植体材料表表面消毒不不彻底或内内生菌随材材料带入；（2）培养养基和接种种工具消毒毒不彻底；（3）接种种室和超净净台不符合合要求；（4）操作作人员不遵遵守操作规规程；（5）培养养过程中环环境空气不不洁净污染染等。2、污染的的控制（1）将材材料冲洗足足够干净，严严格消毒灭灭菌。可采采用多次灭灭菌法。（2）在培培养基中加加入一定量量的抗生素素，如青霉霉素、链霉霉素、新霉霉素、卡那那霉素等，但但抗生素对对培养物的的生长和分分化会产生生一定的抑抑制，应避避免长期使使用。 （3）培养养基灭菌时时，要检

24、查查高压灭菌菌的温度、压力、时时间及操作作是否正常常等。（4）接种种室定期用用紫外灯照照射或酒精精喷雾或甲甲醛薰蒸等等。超净台台接种前用用酒精擦拭拭后再开机机灭菌。（5）接种种前，接种种人员要严严格消毒，认认真洗手，酒酒精擦手；在接种时时规范操作作，常用酒酒精擦手。接种工具具常在酒精精灯火焰上上灼烧。接接种前后培培养器皿开开口需转动动烘烤。3、制备外外植体用消毒毒工具将表表面消毒的的材料作些些处理（芽芽除鳞片、嫩枝除外外皮、种子子去种皮、去胚乳等等，叶片直直接切成00.20.5ccm小片，想想要脱毒苗苗切至茎尖尖0.1mmm内部分分）。4、接种和和培养接种封口置培养室室培养（22528，湿湿度

25、7080%，光光照强度33000 40000lx，日日光灯光照照1016h）继代培养养分化培养养（一般在在基本培养养基中加入入一定配比比生长素与与细胞分裂裂素，超净净台上无菌菌操作）5、诱导生生根将生成成不定芽的的材料转到到生根培养养基上诱导导生根（一一般在基本本培养基中中加入生长长素，超净净台上进行行无菌操作作）。6、炼苗、移栽试管苗苗从一个无无菌、光温温恒定和基基本异养的的环境转移移到有菌、光温变动动和完全自自养的环境境，需要多多方面的调调整，适应应不好会影影响成活。幼苗根根长到一定定长度瓶口打开开，自然光光照3天移出幼苗苗自来水冲洗洗根上培养养基移入基质质（珍珠岩岩、蛭石等等）清水喷湿炼

26、炼苗1d移入大田田栽培七、植物组组培的应用用1、无性系系快速繁殖殖（用材少少，不受季季节限制）2、获得脱脱毒苗（茎茎尖生长点点、花器培培养）3、选育新新品种（1）突变变育种（2）原生生质体融合合和细胞杂杂交（3）花药药、花粉培培养与单倍倍体植株4、有助于于遗传、生生理生化、病理研究究5、保存种种质资源6、产业化化生产八、人工种种子 将将植物组培培产生的胚胚状体包裹裹上用有机机化合物和和营养物质质制作的人工工种皮，就就成了人工工种子。人工种子的的优点：1、快速繁繁殖，便于于运输、贮贮藏；2、可以加加入有益成成分配制，更更利于种子子生长；3、可以固固定杂种优优势，加速速良种繁育育；4、可作为为植物

27、基因因工程和遗遗传工程的的桥梁；5、可以保保存珍贵品品种。体细胞胚包包埋制作人人工种子的的流程： 选选取目标植植物从合适的的外植体诱诱导愈伤组组织形成愈伤组织织转到液体培养养基愈伤组织织增生愈伤组织织转到无激激素培养基基形成体细胞胞胚包裹人工工种皮温室播种种获得目标标植物影响体细胞胞胚发生：N源（Glyy、NH4CCl）C源（蔗糖糖、果糖）基本培养基基：MS或改良良MS培养基基人工胚乳及及人工种皮皮的理想包包埋材料应应具备下列列特性：1、无毒、无害，有有生物相容容性，能支支持胚状体体；2、有一定定透气性、保水性，既既不造成人人工种子在在贮藏保存存过程中丧丧失生活力力，又能保保证其将来来正常萌发

28、发生长；3、有一定定强度，能能维持种子子的完整性性，便于人人工种子贮贮藏、运输输和播种4、可容纳纳和传递胚胚胎发育所所需的营养养物质、生生长和发育育的控制剂剂、以及为为延长贮藏藏寿命而添添加的防腐腐剂、杀菌菌剂等人工种子的的包埋剂：海藻酸盐盐、琼脂、白明胶、角叉菜胶胶、槐豆胶胶等。海藻酸盐是是一种由古古洛糖醛酸酸和甘露糖糖醛酸组成成的多糖，在在Ca2+等离子存存在时，糖糖中的羧基基和阳离子子之间形成成离子键，从从而形成胶胶体颗粒。具有成胶胶容易、操操作条件温温和、使用用方便、毒毒性极低、成本低廉廉、可防机机械碰伤等等优点，不足是保水水性较差，表表面易结团团、营养成成分易流失失。如用磷磷酸、柠檬

29、檬酸、EDDTA等离子复复合剂处理理，胶体颗颗粒又会释释放出细胞胞。海藻酸盐包包埋制作人人工种子具具体操作：先配置置一定浓度度的海藻酸酸钠溶液，比比如2%，高温温高压灭菌菌，将植物物细胞悬浮浮液与海藻藻酸钠溶液液混合倒入入注射器中中，然后慢慢慢滴入含含有CaCCl2的培培养基中，不不断搅拌就就会形成球球形颗粒，过过滤收集颗颗粒，用含含有的Caa2+培养养基清洗，转转入摇瓶中中进行培养养。九、植物组组织与器官官的生物反反应器培养养 气气升式生物物反应器、自旋过滤滤式反应器器十、植物组组织与器官官培养存在在的问题1、研究：理论研究究不够深入入，且难培培养植物研研究不够2、技术：技术不够够成熟，效效

30、率偏低，生生物反应器器技术不成成熟，组培培工业化、产业化尚尚未实现3、可应用用性范围：很多有价价值的植物物未培育成成功，应用用范围较小小第4节 植物物细胞培养养4.1定定义4.2植植物细胞培培养的方法法4.3植植物细胞培培养的培养养基4.4植植物单细胞胞培养4.5植植物细胞培培养的应用用4.6植植物细胞的的生物反应应器大规模模培养4.7植植物细胞两两相培养技技术4.8植植物细胞的的生物反应应器固定化化培养4.9植植物细胞培培养存在问问题与发展展趋势一、定义 在在离体条件下下，将愈伤伤组织或其其他易分散散的组织置置于液体培培养基中进进行振荡培培养，得到到分散成游游离的悬浮浮细胞，通通过继代培培养

31、使细胞胞增殖，从从而获得大大量细胞群群体的一种种技术。植物中含有有数量极为为可观的次次生代谢物物质，是各各种色素、药物、香精、酶等天然产产物的主要要来源。植物细胞培培养具有以以下优点：1、提高产产率2、缩短周周期3、提高产产品质量4、易于管管理，减轻轻劳动强度度因此主主要用于生生产色素、药物、食品、酶、精细化工工产品等次次生代谢物物。紫杉醇是一一种二萜类类化合物，是是一种新发发现的细胞胞有丝分裂裂抑制剂，其其作用机理理在于阻止止微管正常常生理聚集集，抑制癌癌细胞的有有丝分裂和和纺锤体的的形成，从从而使癌细细胞的复制制受到阻断断而凋亡。广泛用于于治疗卵巢巢癌、乳腺腺癌、非小小细胞肺癌癌等十几种种

32、癌症，是是20世纪后后期最受人人们重视的的一种抗癌癌新药，被被公认为是是最有开发发前途、最最有效的抗抗癌药物，获获汤姆森科科技桂冠奖奖。二、方法 琼脂培养养 固固体培养细胞培养 固定化培培养（吸附附、包埋等等） 摇瓶悬悬浮培养（实实验室） 液液体培养 分批培养养 反应器器大 半连续培培养 规模培培养 恒化化培养 连续培养养 恒浊浊培养固定化培养养：将细胞胞固定在载载体上，使使活细胞固固定在一定定的空间范范围内进行行生命活动动的技术。这种方法法保持了细胞胞的生命活动能能力，可以以反复或连连续进行培养，有利利于提高生生产能力和和产物的分分离纯化，并并且省去了含酶酶细胞的处处理过程，所所需的酶系系完

33、整，方法简单单，成本低。固定化化技术有吸附法、包埋法、结合法、交联法等，通常采采用包埋法法，将细胞胞包埋在海海藻酸盐或或卡拉胶中中。反应器大规规模培养：1、分批培培养：一次次性添加培培养液培养养，期间不不更换培养养液。2、半连续续培养：在在培养过程程中每隔一一定时间更更换一部分分培养液或或添加某种种营养成分分。又称流流加培养。3、连续培培养：连续续地以一定定速度添加加培养液或或营养盐，同同时排出旧旧培养液，总总培养液体体积不变。连续培养：1、恒化培培养2、恒浊培培养相关项目恒化培养恒浊培养装置恒化器恒浊器控制对象培养液流速速培养液密度度生长限制因因子有无培养液流速速恒定不恒定生长速度低于最高最

34、高产物不同生长速速度细胞大量细胞或或与细胞生生长平衡的的代谢产物物应用范围实验室为主主生产为主三、培养基基 常常用MS培养基基，另外还还有B5、N6、NT、AA、KM8pp等培养基基四、单细胞胞培养1、制备方方法（1）机械械法（机械械磨碎、切切割）（2）酶解解法（目前前最有效的的获得单细细胞方法）（3）愈伤伤组织诱导导法（高频频振动愈伤伤组织）2、培养方方法（1）平板板法（似微微生物平板板培养）（2）看护护培养与饲饲养层培养养法 看看护培养：将单个细细胞接种到到滤纸上再再置于愈伤伤组织之上上进行培养养。 饲饲养层培养养：用处理理过（如XX射线）的的无活性的的或分裂很很慢、不具具分裂能力力的细胞

35、来来饲养细胞胞。（3）液体体浅层静置置培养法：将一定密密度的悬浮浮细胞在培培养皿中形形成浅薄层层，封口静静止培养。（4）悬浮浮法：将细细胞接种到到液体培养养基中，在在摇床或生生物反应器器中培养。目前多采采用这种方方法进行植植物细胞大大规模培养养。成功的细胞胞悬浮培养养体系应当当满足3个基本条条件：1、悬浮细细胞分散性性良好，细细胞团较小小；2、细胞均均一性好，在在倒置显微微镜下观察察，细胞形形状和细胞胞团大小大大致相同；3、细胞生生长迅速，一一般23天甚至更更短时间可可增加一倍倍。影响悬浮细细胞生长的的因素：1、 起始始愈伤组织织的质量2、 接种种细胞密度度3、培养条条件：方式式、温度、4、

36、继代代周期愈伤组织要要求：松散性性好，增殖殖快，再生生能力强。其外观一一般是鲜艳艳的乳白或或淡黄色，呈呈细小颗粒粒状，松散散易碎。如何获得符符合要求的的愈伤组织织？1、选择适适宜的外植植体：胚、胚轴、子子叶是最常常用的外植植体，特别别是幼胚。2、选择适适宜的培养养基：生长长素浓度很很重要,配合一定定浓度的细细胞分裂素素等。3、愈伤组组织要进行行继代选择择：选择疏疏松性好、生长状态态好的细胞胞不断继代代培养。基本的悬浮浮培养体系系均是将细细胞分散在在一定容积积的培养液液中进行，在在一个培养养周期不添添加培养基基。这种培培养体系基基本是处于于封闭状态态。当一种种营养物质质耗尽时，细细胞即停止止生长

37、。在在这种悬浮浮培养体系系中，细胞胞扩增生长长成S形曲线。3、悬浮培培养同步化化方法（1）物理理法冷处理理、体积选选择（2）化学学法饥饿加尿苷苷抑制细胞胞分裂加秋水水仙素抑制制细胞有丝丝分裂细胞同步化化：同一悬悬浮培养体体系的所有有细胞都同同时通过细细胞周期的的某一特定定时期。植植物细胞在在悬浮培养养中的游离离性较差，容容易团聚进进入不同程程度的分化化状态，因因此要达到到完全同步步化相当困困难。低温法：冷处理可可提高培养养体系中细细胞同步化化程度。分选法：通过细胞胞体积大小小分级，直直接将处于于相同周期期的细胞进进行分选，然然后将同一一状态的细细胞继代培培养于同一一培养体系系中。饥饿法：在一个

38、培培养体系中中，如果细细胞生长的的基本成分分丧失，则则导致细胞胞因饥饿而而分裂受阻阻，从而停停留在某一一分裂时期期。抑制剂法法：通过一一些DNAA合成抑制制剂处理细细胞，如尿尿苷等，使使细胞滞留留在DNAA合成前期期，当解除除抑制后，即即可获得处处于同一细细胞周期G1期的的同步化细细胞。4、保存（1）继代代培养（高高等植物、海藻等）（2）低温温（ 5 10）（3）冷冻冻（ -220 或液氮）植物细胞冷冷冻保存方方法：在冰浴浴条件下加加入预冷的的冰冻保护护剂，密封封，继续冰冰浴15mmin，在在-40停停留2h后投入入-1966液氮罐罐中保存。植物细胞冷冷冻保护剂剂组成：7.5%二二甲基亚砜砜（

39、DMSSO）0.55molL山梨醇5%甘油5%蔗糖五、植物细细胞培养的的应用1、生产药药用植物代代谢产物（紫紫杉醇、苷苷类等）2、生产天天然食品、食品添加加剂（可可可碱等）3、生产杀杀虫剂、杀杀菌剂（鱼鱼藤酮、除除虫菊脂） 4、生产饲饲料、精细细化工产品品（桑叶、橡胶等）六、植物细细胞的生物物反应器大大规模培养养1、培养特特性（1）细胞胞本身特性性（生长慢慢、易结团团、易损伤伤、易污染染）（2）培养养液流变特特性（黏度度增高）（3）气体体传递与影影响（O22与CO2需平平衡）（4）泡沫沫与器壁表表面黏附性性（气泡增增多、黏度度大、易黏黏附，可用用硅油、脂脂肪酸酰胺胺等消除）（5）悬浮浮细胞生长

40、长与增殖（静静止期前继继代）2、培养过过程（1）细胞胞的驯化、筛选与细细胞株的建建立愈伤组组织诱导与与培养单细胞分分离细胞无性性系分离细胞株筛筛选（2）扩大大培养采用逐逐级增加体体积的容器器将优良的的细胞株经经过多次扩扩大繁殖得得到大量细细胞，用作作生物反应应器培养的的种子细胞胞。（3）生物物反应器培培养3、植物细细胞大规模模生物反应应器培养 搅搅拌式、鼓鼓泡式、气气升循环式式4、植物细细胞的生物物反应器高高密度培养养例：培培养紫草细细胞、水母母雪莲细胞胞5、植物细细胞生物反反应器培养养存在的主主要问题生长缓慢；次级代谢谢物含量低低；培养细细胞不稳定定等；多数数产物积累累于胞内；不耐受剪剪切力

41、。必须首先解解决的重要要问题：细细胞生长及及代谢途径径基础研究究、反应器器结构与工工艺优化七、植物细细胞两相培培养技术 两两相培养技技术在培养养体系中加加入水溶性性或脂溶性性的有机物物或者具有有吸附作用用的多聚化化合物，使使培养体系系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移到有机相中的技术。其优点是：不仅减少了产物的反馈抑制作用，提高产物含量，而且通过有机相的回收循环使用实现了连续培养。这种技术最初是应用于蛋白质提取、乙醇发酵及微生物培养上的。两相培养系系统满足条条件：1、添加的的有机物或或多聚化合合物对植物物细胞无毒毒，不会影影响细胞生生长。2、产物能能比较容易易被

42、有机物物吸附或溶溶解于有机机相中。3、两相容容易分离 4、有机物物或多聚化化合物不能能吸收培养养基中的有有效成分。八、植物细细胞的生物物反应器固固定化培养养 细细胞固定化化将游离离的细胞包包埋在多糖糖或多聚化化合物制备备成的网状状支持物中中，培养液液呈流动状状态进行无无菌培养的的一门技术术。 常常用的固定定化方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法等等。常采用用包埋法，可可以采用海海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼琼脂糖、角角叉藻胶、白明胶等等作为包埋埋剂。九、植物细细胞培养存存在的问题题与发展趋趋势1、存在问问题（1）技术术问题生物反反应器设计计缺陷多细胞易易聚集分层层、易变异异放大培培养不足（2）经济

43、济方面 成成本高、工工业化经济济效益低2、发展趋趋势（1）高效效细胞系的的筛选（2）发展展大规模细细胞培养所所用的培养养基，降低低成本（3）开发发出适合植植物细胞大大规模培养养的生物反反应器系统统（4）两相相培养、固固定化培养养技术是极极具发展前前景的技术术（5）对细细胞分化、次生代谢谢产物和培培养条件之之间的关系系进行基础础研究第5节 植物物原生质体体培养5.1定定义、特点点及用途5.2原原生质体的的制备5.3原原生质体的的培养5.4原原生质体的的发育和植植株再生一、原生质质体1、定义 在在植物细胞胞中除细胞胞壁以外的的成分就称称为原生质质体，植物物原生质体体实际上就就是除去细细胞壁的裸裸露

44、球形细细胞。2、特点及及用途 含含有核、质质、膜及各各种细胞器器，只是没没有细胞壁壁。方便进进行各种遗遗传操作，并并能摄取外源源基因、细细胞器、染染色体、质质粒、病毒毒、细菌等等外源物质质，是植物物细胞工程程进行遗传传操作、基因转移移的良好实实验材料。也可以进进行细胞生生理生化研研究，并且且原生质体体具有细胞胞全能性，能能够再生出出细胞壁并并生长发育育成完整植植株，也可可研究细胞胞壁的形成成。另外也也容易克服服不同种细细胞间的不不亲和障碍碍，容易实实现细胞融融合和细胞胞杂交，培培育新品种种。二、原生质质体的制备备1、来源 植植物体的细细嫩部分是是制备原生生质体的理理想材料，比比如双子叶叶植物的

45、幼幼叶、子叶叶、根、下下胚轴的切切段、花粉粉等。叶片片由于取材材容易而广广泛采用，但但单子叶植植物特别是是禾本科植植物叶片表表面常含有有硅质不易易被酶液降降解，不适适宜用来制制备原生质质体，通常常用其组培培产生的愈愈伤组织或或悬浮培养养的细胞。2、分离（1）机械械法（最初初方法）先将材材料放在高高渗蔗糖溶溶液中使细细胞发生质质壁分离，最最后原生质质体收缩成成球形完全全与细胞壁壁脱离，此此时用剪刀刀剪碎组织、切破细胞胞壁，使原原生质体释释放出来。这种方法法操作难度度大，产量量低，费时时费力，且且无法从分分生组织中中分离得到到原生质体体。（2）酶解解法（常用用方法）这是19660年英国国诺丁汉大大

46、学的科金金创立的分分离制备大大量植物原原生质体的的方法。利利用从漆斑斑霉提取的的纤维素酶酶粗制剂，从从番茄幼苗苗根尖分离离出大量原原生质体。这种方法法条件温和和、原生质质体完整性性好、活力力高、得率率高。制备备原生质体体常用的酶酶有：纤维维素酶、果果胶酶、半半纤维素酶酶、琼脂酶酶、蜗牛酶酶等。例：科金分分离制备番番茄根尖原原生质体方方法步骤：（1）取材材消毒：将鲜嫩嫩植物组织织水洗后用用70%酒精精浸泡1mmin，再再用8%次氯酸酸钠浸泡11min表表面消毒，无无菌水洗334次。（2）酶解解制备超净台台上2528恒温温水浴60090miin。（3）原生生质体收集集用3000400目不不锈钢网过

47、过滤酶解材材料，弃去去残渣，6600r/min离离心10mmin，弃弃上清，沉沉淀悬浮在在0.166mol/LCaCCl222H2O溶溶液中，缓缓缓注入220%蔗糖糖溶液，同同速离心110minn，收集两两液面间原原生质体带带备用。3、纯化（1）过滤滤-离心法40100m网筛低低速离心数数次（2）漂浮浮法25%蔗糖溶液液中漂浮吸管（3）沉降降法与漂浮浮法结合低速离离心211%蔗糖悬悬浮离心洗涤液离离心（2次以上）4、鉴定（1）低渗渗爆破（低低渗吸水膨膨胀）吸水胀破后后不成形真原生质质体吸水胀破后后保持一定定形状带带有部分细细胞壁（2）荧光光染色（00.05%0.1%荧光增白白剂）发红光真真原生

48、质体体发绿光细细胞壁未分分解完全5、活力测测定（1）染色色法（FDDA、酚藏藏花红、伊伊文思蓝）FDA（荧荧光素双醋醋酸盐）法法：本没有有荧光，能能透过原生生质膜，并并在内酯酶酶作用下水水解为不能能排出、积积累在质膜膜内的荧光光素。发绿光光活不发荧光光死酚藏花红红染料法：不着色活红色色死伊文思蓝蓝染色法：不着色活蓝色色死（2）胞质质环流法（3）渗透透压变化：吸水、失失水活，不不变死（4）氧电电极法：OO2活，不变变死三、原生质质体培养（1）液体体培养法（2）固体体平板法（3）双层层培养法四、原生质质体的发育育和植株再再生（1）细胞胞壁再生（2）细胞胞分裂（3）愈伤伤组织或胚胚状体的形形成（4）

49、植株株再生（愈愈伤组织诱诱导、诱导导胚状体）所采用技术的理论基础 植物细胞工程通常采用的技术手段 植物组织培养 植物原生质体培养与体细胞杂交植物细胞的全能性植物细胞培养 第三章小结结：一、植物组组织培养（概概念、原理理、培养条条件、常用用仪器、步步骤、应用用、人工种种子等）二、植物细细胞培养（概概念、理论论基础、方方法分类、培养条件件、常用仪仪器、制备备方法、培培养方法、保存方法法、应用、固定化培培养及方法法等）三、两相培培养技术（概概念、优点点、条件）四、植物原原生质体培培养（概念念、用途、制备、培培养、再生生植株方法法及技术路路线等）思考题：1、什么是是植物组织织培养和细细胞培养？有怎样的

50、的区别？2、举例说说明植物组组织培养的的快速繁殖殖技术的步步骤和方法法。3、植物组组织培养的的主要意义义有哪些？最新进展展如何？4、植物细细胞培养最最主要的用用途体现在在哪里？举举例说明。5、植物细细胞培养的的营养成分分主要包括括哪些？6、什么是是两相培养养技术？有有什么优点点？7、简述原原生质体培培养再生完完整植株的的技术路线线。补充思考题题：1、为什么么茎尖分生生组织培养养能够获得得脱病毒植植株？2、培养基基、外植体体、玻璃器器皿、金属属用具等一一般选择怎怎样的灭菌菌方法？3、目前用用作原生质质体分离的的材料有哪哪些？4、哪些类类型的外植植体适宜用用作建立悬悬浮细胞系系起始培养养物？5、一

51、个好好的植物悬悬浮细胞系系有哪些特特征？6、人工种种子利用有有何优点？第四章动动物细胞与与组织培养养一、动物细细胞的特点点二、动物细细胞与组织织培养的定定义三、动物细细胞的体外外培养生长长特性四、动物细细胞、组织织培养的基基本技术五、组织工工程六、器官培培养七、干细胞胞第1节 动物物细胞的特特点动物细胞与与微生物细细胞相比，有有以下特点点：1、比微生生物细胞大大，没有细细胞壁；2、动物细细胞间主要要以聚集体体形式存在在；3、生长慢慢，周期长长，易受污污染；4、原代细细胞一般繁繁殖50代左右右就退化死死亡；5、需O22少，对剪剪切力敏感感。第2节动动物细胞与与组织培养养的定义动物细胞与与组织培养

52、养从动物物体内取出出细胞或组组织，模拟拟体内的生生理环境，在在无菌、适适温和丰富富的营养条条件下，使使离体细胞胞或组织生生存、生长长并维持结结构和功能能的一门技技术。原代培养将机体体取出的细细胞或组织织进行实效效培养的过过程。实效效培养的细细胞大约增增殖10代左右右，称原代代细胞。传代培养从原代代培养的细细胞继续转转接培养的的过程。第3节 发展历历史（自学学）第4节节动物细细胞体外培培养的生长长特性一、贴附型型细胞 贴贴附生长的的细胞。也也就是细胞胞与细胞之之间接触、与细胞外外基质结合合生长。大大多数哺乳乳动物细胞胞属于此类类型。1、成纤维维细胞型细细胞（如人人胚肺细胞胞、小鼠成成纤维细胞胞等

53、）2、上皮型型细胞（如如表皮细胞胞、宫颈癌癌细胞等）3、游走型型细胞（如如淋巴细胞胞、巨噬细细胞等）4、多形型型细胞（如如神经元、神经胶质质细胞等）二、非贴附附型细胞（悬悬浮生长，如如血液白细细胞、淋巴组织织细胞）第5节 动物物细胞、组组织培养的的基本技术术5.1培培养工具5.2培培养条件5.3动动物细胞培培养的传统统方法5.4原原代培养与与传代培养养技术5.5贴贴壁培养技技术5.6动动物细胞大大规模培养养技术5.7动动物细胞生生物反应器器大规模培培养5.8细细胞冷冻保保存技术5.9动动物细胞体体外培养举举例5.10动物细胞胞体外培养养现状与展展望一、培养工工具 培养器器皿（玻璃璃、塑料）、空

54、心纤维维、微珠二、培养条条件1、温度（337）2、pH值值（pH77.27.4）3、气体（OO2、CO2）4、营养（氨氨基酸、维维生素、辅辅酶、核酸酸、嘌呤、嘧啶、激激素、生长长因子、葡葡萄糖、无无机盐等，其其中多种成成分可由血血清提供）（1）天然然培养基（血血清、鸡胚胚汁等）（2）合成成培养基（MEM、DMEM、DME等）（3）无血血清培养基基（SFRRE1999-1等）此外还有一一种微囊法法，是美国国Damoon Biiotecch公司发发明的方法法。具体是是：将细胞胞悬浮于海海藻酸钠溶溶液中，迫迫使其通过过一种成滴滴装置后滴滴入溶液，即即形成半透透膜微囊，把把细胞包在在内，培养养时废物可

55、可通过半透透膜排出，所所需要的大大分子产物物如抗体则则被阻留积积累在囊内内，最后只只需离心收收集微囊并并打开囊膜膜，就可分分离获得高高浓度的未未经培养液液血清污染染的大分子子产物。（1）天然然培养基直接采采用动物体体液或从组组织中提取取的成分作作为培养液液，主要有有血清、组组织提取液液、鸡胚汁汁等，其中中血清是最最常用最有有效的，已已知血清中中含有：蛋白质（白白蛋白、球球蛋白、铁铁蛋白等）氨基酸葡萄糖激素（胰胰岛素、生生长激素等等）金属离子子促贴附物物质（纤粘粘蛋白、冷冷析球蛋白白、胶原等等）生长因子子（EGFF、FGF、MSA、IGF等）维持细胞胞生长繁殖殖及保持生生物学性状状不明成分分血清

56、常用牛牛血清和马血清（HS,hhorsee serrum），牛牛血清又分分为胎牛血血清（FBS,fetaal boovinee serrum）和和犊牛血清清（CS,ccalf seruum）。血血清质量好好坏是实验验成败的关关键。优质血清的的标准：透透明，淡黄黄色，无沉沉淀物，无无细菌、支支原体、病病毒污染血清的消毒毒：过滤除除菌优点：营养养成分丰富富，培养效效果好。缺点：来源源有限；成成分复杂，影影响对某些些实验产物物的提取和和实验结果果的分析；易发生支支原体污染染；影响后后期分离、纯化细胞胞产物；成成本高。（2）合成成培养基根据细细胞生存所所需物质的的种类和数数量，用人人工方法模模拟合成的

57、的培养基，如如MEM、DMEMM、DME、M1999、F12、RPMII16400等培养基基，需加入入520%血清清，最常用100%小牛血血清。优点：成分分已知，便便于对实验验条件控制制，能进行行标准化生生产，成本本低。缺点：不能能完全取代代天然培养养基的成分分，需加入入血清，具具血清的缺缺陷。（3）无血血清培养基基一般由由基础培养养基、生长因子子和激素、基质组成，主主要以各种种激素、生生长因子、维生素、载体蛋白白、微量元元素、乙醇醇胺以及贴贴壁与展开开因子取代代含血清培培养基中的的血清部分分。常用培培养基有DME、F12、RPMII16400等，其中中又以11的DME和F12混合合培养基最最

58、为常用。专用无血血清培养基基如SFRRE19991、NCTCC135等等。常用基基质有纤黏黏素、血清清铺展因子子、胎球蛋蛋白、胶原原等。优点：排除除了血清的的干扰，保保证了实验验结果的准准确性、可可重复性和和稳定性，减减少了细胞胞污染，简简化了提纯纯和鉴定各各种细胞产产物的程序序。缺点：不同同细胞株添添加因子不不同；处于于研究阶段段，难以推推广。（4）培养养必需的溶溶液BSS（Hankks、Earlle等）pH调整整液（NaaHCO33、HEPEES等）细胞消化化液（胰蛋蛋白酶、EEDTA等等）抗生素溶溶液（青霉霉素、链霉霉素、卡那那霉素、制制霉菌素等等）BSS（Hankks、Earlle等）

59、由生理理盐水和葡葡萄糖配成成，用于维维持细胞的的渗透压、维持pHH和细胞正正常的代谢谢等。葡萄糖糖在培养液液中的含量量一般为11g/L（低低糖）或44.5g/L（高糖糖）。 Haanks 平衡盐溶溶液(HBBSS) 和 Earlle平衡盐盐溶液(EEBSS)的主要差差别在于碳碳酸氢钠的的水平，在在Earlle(2.2g/LL)中比在在Hankks (00.35gg/L) 中高。 Hankks 液缓缓冲能力较较弱，Earlle液缓冲冲能力较强强。碳酸氢氢钠需用高高水平的CCO2平衡衡，以维持持溶液的ppH值。Earrle液在在空气水平平的CO22 中会变变碱，Haanks液液在CO22培养箱中中

60、会变酸。Hankks 液要要在空气中中使用，不不需要COO2培养箱箱。如果希希望在COO2培养箱箱中保存组组织，需要要用Earrle液。如果仅仅仅是清洗洗将要在细细胞培养基基中储存的的组织，用用Hankks液就可以了了。 pH调整整液（NaaHCO33、HEPEES等）常用的的有3.77%、5.6%、7.4%NaHCCO3、HEPEES液（二二羟乙基哌哌嗪乙烷磺磺酸）等。培养基基中NaHHCO3 的含量将将决定细胞胞培养时应应使用的CCO2 浓浓度。当培培养基中NNaHCOO3 含量量为3.77 g/LL 时，细胞胞培养时应应使用100 % CCO2；当当培养基中中NaHCCO3 为为1.5