多种植物的ISSR分子标记及相似性分析

1、生物大实验报告学院： 班级： 姓名： 学号： 组别： 指导老师:多种植物的ISSR分子标记及相似性分析摘 要：近年来，人们发现了一种新型的分子标记一一ISSR。它是以生物 大分子的多态性为基础的遗传标记，能够直接对基因组DNA进行分析，反映植 物在遗传物质DNA水平上的差异并不受任何环境条件影响，是植物遗传育种领 域内一项新兴技术。文章就是通过上述方法来分析五种不同植物的遗传多样性并 建立了聚类树。关键词：分子标记ISSR DNA差异分析Abstract: In recent years, people have discovered a new technology of molecular

2、 markers-ISSR. It based on the polymorphism of biological macromolecules genetic markers, which can directly be used in the genomic DNA analysis and can reflect the difference of plants in the genetic material of the DNA level and it is not effected by any environment condition .So, it is a new tech

3、nology in the field of plant genetic breeding. The article analyse the five different plants genetic diversityis through the above method and set up the clustering tree.Key words： Molecule Marker Technology ISSR the analysis of DNA differences1刖言ISSR (inter-simple sequence repeat) 标记是一种类似RAPD，但利用包含

4、重复序列并在3或5锚定的单寡聚核 酸引物对基因组进行扩增的标记系 统，即用SSR引物来扩增重复序列之 间的区域。其原理具体是，ISSR标记 根据生物广泛存在SSR的特点，利用 在生物基因组常出现的SSR本身设计 引物，无需预先克隆和测序。用于扩 增的引物一般为16-18个碱基序列，由 1-4个碱基组成的串联重复和几个非 重复的锚定碱基组成，从而保证了引 物与基因组DNA中SSR的5或3末 端结合，导致位于反向排列、间隔不 太大的重复序列间的基因组节段进行 PCR扩增。2 ISSR的原理简单序列重复区间扩增多态性 (Inter-simple sequence repeat，简称 ISSR)是一种

5、新型的分子标记，是由 Zietkiwicz(1994)等创建的一种简单序 列重复区间扩增多态性分子标记。它 的分子生物学基础是基因组中存在的 简单序(simple sequence repeat，简称 SSR)，且具有同SSR 一样丰富的多 态性。ISSR标记根据植物中广泛存在 SSR的特点，利用植物基因组中常出 现的SSR本身设计引物，无需克隆和 测序。用于ISSRPCR扩增的引物通 常为1618个碱基序列，由14个 碱基组成的串联重复和几个非重复的 锚定碱基组成，从而保证了引物与基 因组DNA中SSR的5或3末端结 合，通过PCR反映扩增SSR之间的 DNA片段。ISSR技术是在SSR序列

6、 的5或3末端加上24个随机选择 的核苷酸作为引物，以引起特定序列 位点的退火，降低其他可能靶标退火 的数目。因而避免了引物在基因组上 的滑动，可提高PCR扩增反映的专一 性。测定过程中以锚定SSR寡聚核苷 酸为引物，以位于反向排列于SSR之 间的DNA序列为基础进行PCR扩 增，用1722个碱基的重复锚定引 物扩增重复序列之间的片段，而不是 扩增SSR本身，其在引物设计上比 SSR技术简单得多，不需知道DNA 序列即可进行扩增，又可以提示比 RAPD、SSR更丰富的多态性。ISSR 典型的反映每个泳道可产生20多条 带，条带的多少取决于不同的物种和 引物。例如：Nagoka和Ogihara在

7、小 麦的ISSR标记研究中发现ISSR标 记可获得几倍于RAPD标记的信息 量。SSR在真核生物中的分布非常普 遍，并且进化变异速度非常快，因而 锚定引物的ISSR- PCR可以检测基因 组许多位点的差异。在实验中，ISSR引物可直接在 基因组DNA中进行PCR扩增，用琼 脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，无 需预先知道基因组DNA中的任何序 列信息即可检测，扩增谱带丰富OISSR 技术可以快速、高效、灵敏地检测出 基因组DNA的多态性，且具有良好的 重复性，操作简便、成本低，更适合 大样本的检测。ISSR标记技术利用了 基因组丰富的SSR序列信息，与SSR 相比，ISSR不需要预先获知序列信 息

8、，程序简化、成本降低；同时与 RAPD相比，ISSR更具可靠性，重复 性高，每个引物都能产生较高的多态 性，同时具备RAPD的简便、易操 作等特点；与RFLP、AFLP相比， ISSR更快捷、稳定、成本较低、DNA 用量小、安全性较高。由于上述优点， ISSR标记技术在种群遗传学、种质资 源分类学与种系发生学等方面得到了 迅速而广泛的应用。3材料试剂与方法步骤3.1材料的采集在贵州大学食科楼、动科楼、神 农氏等前面采集了三叶草、大叶黄杨、 小叶黄杨、紫花苜蓿、和八角枫。3.2化学试剂液氮，2xCTAB提取液，p -巯基乙 醇，氯仿，异戊醇，无水乙醇，1xTE， IxTAE缓冲液，琼脂糖胶DNA

9、的提取及检测取新鲜幼嫩叶片约0.5 g置于灭菌 预冷的研钵中，加适量的液氮快速研 磨全粉末，迅速分装至2.0 ml灭菌冷 冻的离心管中，我组一共采集了五种 植物，以防万一，每种植物分装成A,B 两管；加入700皿的预热的2 X CTAB提 取液，10皿的。-巯基乙醇，充分混匀 后，于65C水浴约40分钟，每10 min 上下颠倒数次；12 000 r/m离心10 min；取上清液 加等体积的氯仿：异戊醇（24:1 ），混 匀后 12 000 r/m 离心 10 min；重复上个步骤步骤2次；取上清液加入2倍体积的冰冻无 水乙醇，轻轻混匀，有白色絮状沉淀 生成，6 000 r/m离心3 min，

10、弃水相留 沉淀；加70%乙醇清洗3次，使沉淀自 然风干；加适量的1 X TE缓冲液溶解沉 淀，于一20C下长期保存。用琼脂糖凝胶电泳检测是否提出 来了 DNA。PCR反应体系的构建3.4.1 PCR扩增程序：945 m in预变性94r30s变性4d个循环56.45s退火72V2 m in延伸72V7min3.4.2 PCR反应体系：模板1皿、1U Taq酶0.4四l、10X PCR buffer 2.0 四l，ISSR 引物(10p mol/L)1.2 四l， dNTP(2.5mmol/L)2.1四l, MgCl2 （25 mmol/L） 1.8 四 1,双蒸 水补足到20四1。PCR扩增结

11、束后，取出扩增产物 置于4C冰箱待检测。3.4.3 ISSR- PCR扩增产物的电泳PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电 泳检测。电极缓冲液为1XTAE,电压 不超过5V/CM，在Bio-Rad凝胶成像 系统上观察并拍照保存。ISSR 分析根据扩增产物的琼脂糖凝胶电 泳，对ISSR电泳胶图进行人工读带， 同一位置上DNA带的有无进行统计， 有带（包括弱带）赋值为“ 1”，无带 赋值为“0”，形成0，1 一矩阵。采用 NTSYSpc 2.10e 软件进行 Qualitative data进行矩阵分析和SAHN Clustering 进行相似性系数计算，并构建亲缘关 系树状图。4结果与分析4.1实验

12、结果4.1.1植物DNA提取的检测4.1.2琼脂糖电泳结果（原始条带） 八角紫花小叶大叶三叶 枫苜蓿黄杨黄杨草4.1.3用EXCEL建立表格并转换成“5.0/95工作簿”格式（见下图）119501二草0大叶黄杨小叶黄杨紫花苜蓿001八角枫 02100003101104】00.0510111舌1100711100811110910101100100011111101210011131.1111140001015100101601000170101018-110001901000 J4.1.4 通过NTsys 2.10e软件得到的 五种植物的序列相似性4.1.5为这五种植物建立聚类树三薜榆1雌Cc

13、kEche4.2结果分析4.2.1植物基因组提取分析从上面的基因组提取的DNA来看， 我组的五种植物 (1A,1B;2A,2B;3A,3B;4A,4B;5A,5B) 都提取出来了，但是点样孔上分别表 现了不同程度的明亮，其中以 1A,1B,3A,3B,5A,5B最为明显，这可能 是因为在提取DNA，用枪头吸取时可能 误吸取到了中间的那层蛋白，以至于 跑琼脂糖凝胶电泳时，由于蛋白质分 子量太大而跑不下来，并且大分子蛋 白质还可能会把DNA给裹住，最终沉 积在点样孔，因此导致点样孔特别亮。4.2.2琼脂糖凝胶电泳分析从原始条带中可以看出，后四种 植物跑出的条带较清晰并且数量稍 多，第一种植物的条带

14、，不仅数量上 较少而且也有些模糊。但是总的来 说还是不错的。4.2.3“0,1”矩阵分析从图片中可以看出，我们的总带 数为19。我个人认为这个数字实在是 有点偏小了。可能是因为植物种类多 种多样，但是在进行PCR操作时，我 们只用了随机834和842的两种引物， 而不是经过精挑细选的适合于该物种 的PCR扩增引物，所以我认为有些条 带可能在PCR扩增这一步就没有被扩 增出来，于是由于DNA序列的量太过 稀少，用琼脂糖凝胶电泳检测时就检 测不出来(主要表现在紫花苜蓿和八 角枫上)，以致于总带数只有19条。4.2.4相似性分析从图片上可以看出，小叶黄杨和 八角枫的数据最大，竟达到了 0.73684

15、21；大叶黄杨与紫花苜蓿以及 大叶黄杨与八角枫相似度最小，都是 0.3684211。其余的就介于这二者之 间，仔细看不难发现，其中三叶草与 八角枫、大叶黄杨与小叶黄杨、小叶 黄杨与紫花苜蓿的相似度都是 0.5263158。根据求平均值计算，平均 相似度为 0.52631579，与 0.5263158 几乎一致。4.2.5聚类树分析从聚类树可以看出，树总体分为了 两个部分，其中三叶草、紫花苜蓿、 小叶黄杨及八角枫为一个部分，大叶 黄杨为另一部分。那是因为大叶黄杨 是被子植物门，双子叶植物纲，卫矛 目，卫矛科，卫矛属的植物，其它四 种植物的分类地位和它大相径庭。在 平均相似度的节骨眼上，聚类树又分 成了两部分，一个部分是三叶草和紫 花苜蓿，另一个部分是小叶黄杨和八 角枫。三叶草和紫花苜蓿同属豆科的 植物，因此他们的相似度达到了 0.6315789。但是有一点让我诧异的 是，最高的相似度竟然不是同为豆科 植物的三叶草和紫花苜蓿，而是处于 山茱萸科八角枫属的八角枫和处于黄 杨科黄杨属的小叶黄杨。我还是认为 这是由于PCR扩增时的随机引物而非 最适引物所导致八角枫的琼脂糖凝胶 电泳条带太少，用软件比对时才会使 它们两的相似度达到0.7368421。如果 每一种植物都用其合适的引物来扩增 条带，那么我认为不论是八角枫还是其它的植物都