浅谈麻痹性贝毒的分析方法研究进展

1、浅谈麻木性贝毒的分析方法研究进展摘要针对麻木性贝毒的检测技术,着重从生物学测试方法、化学测试分析方法2个方面概括地介绍了贝毒检测技术研究的进展。总结了几种相关检测技术各自的优点和缺乏及几种方法有机结合和优势互补,提出了技术的革新和新方法的使用将是贝类毒素检测手段的开展方向。关键词麻木性贝毒;分析方法;生物学测试法;化学测试法advaneintheresearhethdtdeterinediarrhetishellfishpisnsshihang-leizhuzhi-gangliutngdingjia-linyuyng-gang(thefisherytehnlgyspreadstatinflvs

2、hunindalianityflianingprvine,dalianlianing116041)abstratinthispaper,fusingnthedetetinfparalytishellfishpisningtehniques,thebilgialtestingethds,andheialtestanalysisethdseredesribedingeneralnshellfishpisningdetetintehnlgyprgress.theadvantagesanddisadvantagesfseveralrelateddetetintehniques,ehnlgyandnee

3、thdlgyillbethediretinfrshellfishtxins.keyrdsparalytishellfishpisningtxins(psp);analytialethd;bilgialethd;heialethd随着社会的开展,人们的生活质量渐渐进步,各种海产贝类食品越来越多地进入了寻常百姓家的餐桌,并且越来越受到欢送。然而人们在享受美味的同时,却不知道有些贝类是有毒的,使近年来贝类中毒事件频繁发生1-3。海洋中的贝类有扇贝、蛤蜊、贻贝等,它们均以生活在海水中的单细胞藻类为食物。但有些单细胞藻类是有毒的4,当贝类摄食了大量有毒藻类时,毒素就会在贝类体内累积,使贝类具有毒素,这种

4、毒素称为贝毒。贝类中的毒素以麻木性贝毒与腹泻性贝毒的危害最严重,加热和冷却均不能将其破坏5。而麻木性贝毒是剧毒性化合物,对生物神经系统或心血管系统有高度特异毒性。世界各国对其进展了大量的研究和分析5-6,为此笔者对国内外麻木性贝毒中常见的分析方法进展综述,为研究麻木性贝毒提供理论帮助。1生物学测试方法1.1小鼠生物测试法小鼠生物测试法是最为常见的一种测试海洋生物毒素的方法。主要是因为小鼠是一种啮齿哺乳类动物,繁殖很快,容易饲养。目前,小鼠腹腔注射检测psp毒素的方法成为美国分析化学协会(asseiatinffialanalytialheists,aa)的标准方法7。由于psp毒素在ph值34时

5、最稳定8;提取物中大量的盐,主要是na+会降低生物测试的毒性值9,因此在试验中要严格控制毒素提取溶液的ph值和盐的含量。牡蛎样品中积累的锌元素也会对小鼠有致死作用,导致测试分析结果偏高10。同时由于不同品系的小白鼠对psp的敏感性差异较大,故标准方法中选用ir品系小鼠为测试动物,以15in内将1只体重为20g的ir品系的雄性小鼠杀死的毒性定义为1鼠单位(u),1u=0.18pgstx。1.2其他生物体内测试法家蝇生物测试法分析psp:将psp的酸性提取液注入家蝇的体内,观察家蝇的活动特征,并记录死亡时间。分析方法与小鼠生物测试很相近。用该方法检测贝样中psp的最低限为20pgstxeq/100

6、g贝组织11。但由于该方法需要借助显微镜注射样品,操作困难,没有被推广使用。蝗虫生物测试法分析psp:沿蝗虫的腹部在体节之间注射10l的测试样品,观察并记录一定时间内被麻木蝗虫的百分率。结果发现,该方法与小鼠生物测试和液相色谱等分析结果根本一致12。1.3细胞毒性测试法细胞毒性测试法也叫组织培养分析法,该方法测试psp毒素的原理是箭毒、藜芦定对神经母细胞瘤na+通道具有协同的开放作用,可增进na+向细胞内的流动,从而引起细胞内外浸透压的改变,使细胞形态肿胀甚至导致细胞裂解死亡。作为na+通道阻断剂的psp毒素可拮抗这种细胞肿胀作用,并且拮抗程度与毒素的剂量具有很好的相关性。jellett等13

7、应用这一原理建立了测试psp的方法,主要步骤是将别离的小脑神经细胞悬浮于一定的培养基中,该细胞一旦在培养基中分化,可以表达对psp敏感的电压依赖式na+通道。用一定浓度的藜芦定处理,向培养基中分别参加不同浓度的psp提取液或不同稀释度的标准毒素,24h后用二乙酸荧光素和嗅化乙锭等荧光剂处理细胞。在荧光灯下,存活的神经细胞呈现绿色,而死亡细胞的核呈现红色。根据存活细胞占总细胞的百分率计算测试样品中的毒素含量。该方法的最低检出限约为40gstx/100g组织。目前,由jellettbitekltd.公司建立的用于psp检测的神经细胞生物分析装(istt),市场上已有销售,并且使用该装置测试贝类中的

8、psp得到了很好的结果。该装置的最低检出限为2gstxeq/100g贝肉,灵敏度远远高于小鼠生物测试法。但由于其组织培养期较长,本钱相对较高,没有得到普遍推广。1.4免疫测试分析法目前,利用免疫测试分析法检测stx毒素的试剂盒(ridasreenr-biphar,darstad,gerany)已经上市,但还未经美国分析化学家协会(aa)确认为标准测试方法。其主要缺点是其他psp毒素之间的穿插反响难以防止。由jelletbitekltd.公司开发的基于侧向流免疫色谱分析psp毒素的ist试剂盒,可以在20in内完成定盆分析,可以作为排除阴性样品的预扫描手段14。只需要比拟测试色带上2条线的颜色即

9、可,和ph试纸的使用一样简便。每一种psp毒素类型在管理标准附近都可以检测。但由于不同种psp毒素对抗体混合物的亲和力有较大的差异,不同毒素组成的样品测量结果波动较大,也难以对样品进展准确定量。1.5放射受体分析法对于psp毒素的分析,人们建立了放射受体分析法15,其主要原理是:取大鼠大脑细胞膜上的na+通道受体固定在微滴板外表,通过待测样品和氛标记的标准stx(3h-stx)与受体的竞争性结合,来测定样品中psp毒素的毒性。该方法对psp毒素的敏感性极高,检出限达4ngstxeq/in。2化学测试方法2.1电泳技术测试法2.1.1平板电泳法。对于psp毒素的检测,人们使用凝胶和纸电泳技术建立

10、了多种别离检测方法16。该方法通常使用过氧化氢显色,用紫外灯检测,可以快速检测一些样品,但其对样品是无法定量的。后来有人使用扫描荧光检测器进展检测,进步了这种方法的灵敏度17。2.1.2毛细管电泳法。毛细管电泳(apillaryeletrphresis,e)是一种相对较新的技术,在生物毒素的分析方面将会有很广泛的应用。总的来讲,该方法是使用很细的熔硅材质的毛细管(id约为100)代替了电泳凝胶,在测试前向毛细管中参加几纳升的样品,给毛细管加高电压后样品就会沿着毛细管迁移,在迁移过程中不同组分的毒素到达别离的效果,再经过荧光或紫外检测池进展检测。这一技术拓宽了分析对象的应用范围,甚至对没有净电荷

11、的物质也可以进展检测。right等18利用e系统和荧光检测器建立了分析stx毒素的方法,检测限达1pg/kg。但该系统需要对stx毒素衍生后再进展检测,设备也非常昂贵。thibault利用e系统和紫外检测器建立了分析nestx和stx毒素的方法,但其检出限太高,目前只能用于对天然产物的初扫描。2.2色谱技术测试法2.2.1薄层色谱法。薄层色谱法(thinlayerhratgraphy,tl)是将固定相涂布在平板(玻璃板、铝箔等)上,点样后用适宜的流动相进展洗脱,不同组分的毒素将在平板上别分开。目前,该方法已广泛用于食品分析领域。在检测psp毒素时,一般使用硅胶作固定相,用丁醇醋酸水或者嗜咤乙酸

12、乙酯醋酸水等溶剂系统作为流动相。显色时使用h22、kh、abre试剂、fastblueb试剂等作为氧化剂。shptaugh等19发现h22和kh可使stx和gtx2产生荧光,便于检测。2.2.2液相色谱法。液相色谱法(liquidhratgraphy,l)在海洋生物毒素的化学检测方法中占主导地位。该方法在20世纪90年代成为psp分析技术研究领域的热点。在过去的10余年中人们建立了l分析psp毒素的常规方法,并逐步完善。1988年,sullivan20使用离子交换色谱和柱后衍生建立了分析psp的方法,可分析12种氨甲酞基和磺化氨甲酞基psp毒素。但该方法对stx和dstx毒素的分辨率很低21,

13、未得到推广。thibault等使用离子对试剂和切换洗脱液的方法可以进步脱氨甲酞基毒素的分辨率。由于柱后衍生系统的使用带来了峰扩展的问题,为此有人提出使用柱前衍生的方法22,但不可以分辨psp毒素中的某些手性异构体。shia23使用三次等梯度洗脱和柱后衍生的方法可以分析绝大多数的psp毒素。由于psp毒素缺少发色基团,并且不同的毒素在不同衍生条件下获得产物的比率不同,不同产物的荧光信号强度也有较大的差异,因此在分析时需要有标准毒素才可以进展定性和定量分析。对毒素的分析,一般采用水解的方法进展间接分析。2.2.3色谱联用技术。色谱联用是指通过一个适宜的方式,将用于定性分析的质谱联接成为色谱别离后的

14、检测器,可充分发挥色谱的别离优势和质谱的定性优势,到达对样品很好地定性和定量分析的目的。液质联用依赖于高效液相色谱把psp成分通过界面装置带到质谱中。有2种界面技术可用,一种是电喷雾电离(esi),另一种是大气压化学电离(ap-l),这2种技术目前都已经应用于psp分析。eike等24采用高效离子交换色谱,样品柱后电化学氧化,平行使用荧光和s检测器分析psp毒素,检测限为0.8g/g。该方法的优点是使用nh4h3水溶液作为流动相进展阴阳离子交换结合层析,这种流动相可以进展在线l-s分析,并且可以在一次进样层析中别离stx、gtxs、nestx、dstx等麻木性贝毒,省去了aa传统色谱分析方法中

15、繁琐的毒素别离前处理过程。eike还对此方法做了改良,使用e(毛细管电泳)代替荧光检测器,采用l-s联用技术,分析麻木性贝毒,结果比只使用带荧光检测器的l高一个数量级。3结语近年来,由于工业废水、生活污水等大量排入,造成海水富营养化,导致赤潮频发。赤潮中藻类大量繁殖,对贝类养殖业造成严重的经济损失,更是危害人类安康,有关psp的中毒事件屡见不鲜,而我国开展psp方面的研究还不够深化,麻木性贝毒在双壳贝类体内的动力学研究起步比拟晚,仅涉及psp毒素在贝体内的累积、排除和转化规律等有关问题25。psp毒素作为海洋生物活性物质药物的研究,也少有文章报道。海产贝类作为我国主要出口创汇产品之一,还未形成

16、配套的卫生质量标准及监测监控体制。由于无法提供养殖海域贝毒监测资料,自1997年欧盟对我国的养殖贝类产品制止进口以来,到目前为止欧洲市场一直未对我国开放。为了维护和开展我国贝类养殖业,确保海产品的食用平安和促进海产品的出口贸易等,我国应在以下几个方面加强研究:一是加强保护近岸海域养殖生态环境;二是研制快速检测psp使用的试剂盒;三是psp毒素标准品的制备;四是寻找psp中毒的治疗解药;五是制定我国psp的监测方案和水产品的happ体系。4参考文献1邱德金,林永水,周近明,等.利玛原甲藻腹泻性毒素的生物学测定j.热带海洋,1996(4):46-49.2迟玉森,胡德亮,赵光莉.扇贝毒素及扇贝食用的

17、平安性j.食品科学,1997(12):45-46.3梁松,钱宏林.加强贝毒管理工作的讨论j.海洋通报,1993,12(2):83-88.4田口滋之.东北沿岸域贝毒问题j.沿岸海洋研究,1994,32(1):55-67.5野口玉雄.麻性贝毒j.海洋科学,1984,16(10):587-594.6林燕棠,杨美兰,陈瑞雯,等.广东沿海麻木性贝类毒素的研究j.海洋与湖沼,1994,25(2):220-225.7hllingrtht,ekell.fishandtherarineprduts959.08.paralytishellfishpisning.bilgialethd,finalatinhellr

18、ihlk.fiialethdsfanalysisftheasseiatinffii-alanalytialheists(15theditin),1990:881-882.8许敏,赵以军,程凯.水华和赤潮的毒素及其检测与分析j.湖泊科学,2001,13(4):376对于psp毒素的分析,人们建立了放射受体分析法15,其主要原理是:取大鼠大脑细胞膜上的na+通道受体固定在微滴板外表,通过待测样品和氛标记的标准stx(3h-stx)与受体的竞争性结合,来测定样品中psp毒素的毒性。该方法对psp毒素的敏感性极高,检出限达4ngstxeq/in。2化学测试方法2.1电泳技术测试法2.1.1平板电泳法。

19、对于psp毒素的检测,人们使用凝胶和纸电泳技术建立了多种别离检测方法16。该方法通常使用过氧化氢显色,用紫外灯检测,可以快速检测一些样品,但其对样品是无法定量的。后来有人使用扫描荧光检测器进展检测,进步了这种方法的灵敏度17。2.1.2毛细管电泳法。毛细管电泳(apillaryeletrphresis,e)是一种相对较新的技术,在生物毒素的分析方面将会有很广泛的应用。总的来讲,该方法是使用很细的熔硅材质的毛细管(id约为100)代替了电泳凝胶,在测试前向毛细管中参加几纳升的样品,给毛细管加高电压后样品就会沿着毛细管迁移,在迁移过程中不同组分的毒素到达别离的效果,再经过荧光或紫外检测池进展检测。

20、这一技术拓宽了分析对象的应用范围,甚至对没有净电荷的物质也可以进展检测。right等18利用e系统和荧光检测器建立了分析stx毒素的方法,检测限达1pg/kg。但该系统需要对stx毒素衍生后再进展检测,设备也非常昂贵。thibault利用e系统和紫外检测器建立了分析nestx和stx毒素的方法,但其检出限太高,目前只能用于对天然产物的初扫描。2.2色谱技术测试法2.2.1薄层色谱法。薄层色谱法(thinlayerhratgraphy,tl)是将固定相涂布在平板(玻璃板、铝箔等)上,点样后用适宜的流动相进展洗脱,不同组分的毒素将在平板上别分开。目前,该方法已广泛用于食品分析领域。在检测psp毒素

21、时,一般使用硅胶作固定相,用丁醇醋酸水或者嗜咤乙酸乙酯醋酸水等溶剂系统作为流动相。显色时使用h22、kh、abre试剂、fastblueb试剂等作为氧化剂。shptaugh等19发现h22和kh可使stx和gtx2产生荧光,便于检测。2.2.2液相色谱法。液相色谱法(liquidhratgraphy,l)在海洋生物毒素的化学检测方法中占主导地位。该方法在20世纪90年代成为psp分析技术研究领域的热点。在过去的10余年中人们建立了l分析psp毒素的常规方法,并逐步完善。1988年,sullivan20使用离子交换色谱和柱后衍生建立了分析psp的方法,可分析12种氨甲酞基和磺化氨甲酞基psp毒素

22、。但该方法对stx和dstx毒素的分辨率很低21,未得到推广。thibault等使用离子对试剂和切换洗脱液的方法可以进步脱氨甲酞基毒素的分辨率。由于柱后衍生系统的使用带来了峰扩展的问题,为此有人提出使用柱前衍生的方法22,但不可以分辨psp毒素中的某些手性异构体。shia23使用三次等梯度洗脱和柱后衍生的方法可以分析绝大多数的psp毒素。由于psp毒素缺少发色基团,并且不同的毒素在不同衍生条件下获得产物的比率不同,不同产物的荧光信号强度也有较大的差异,因此在分析时需要有标准毒素才可以进展定性和定量分析。对毒素的分析,一般采用水解的方法进展间接分析。2.2.3色谱联用技术。色谱联用是指通过一个适

23、宜的方式,将用于定性分析的质谱联接成为色谱别离后的检测器,可充分发挥色谱的别离优势和质谱的定性优势,到达对样品很好地定性和定量分析的目的。液质联用依赖于高效液相色谱把psp成分通过界面装置带到质谱中。有2种界面技术可用,一种是电喷雾电离(esi),另一种是大气压化学电离(ap-l),这2种技术目前都已经应用于psp分析。eike等24采用高效离子交换色谱,样品柱后电化学氧化,平行使用荧光和s检测器分析psp毒素,检测限为0.8g/g。该方法的优点是使用nh4h3水溶液作为流动相进展阴阳离子交换结合层析,这种流动相可以进展在线l-s分析,并且可以在一次进样层析中别离stx、gtxs、nestx、dstx等麻木性贝毒,省去了aa传统色谱分析方法中繁琐的毒素别离前处理过程。eike还对此方法做了改良,使用e(毛细管电泳)代替荧光检测器,采用l-s联用技术,分析麻木性贝毒,结果比只使用带荧光检测器的l高一个数量级。3结语近年来,由于工业废水、生活污水等大量排入,造成海水富营养化,导致赤潮频发。赤潮中藻类大量繁殖,对贝类养殖业造成严重的经济损失,更是危害人类安康,有关psp的中毒事件屡见不鲜,而我国开展psp方面的研究还不够深化,麻木性贝毒在双壳贝类体内的动力学研究起步比拟晚,仅涉及psp毒素在贝体内的累积、排除和转化规律等有关问题2