质粒DNA的提取－碱裂解法实验原理及步骤

1、实验二 质粒DNA的提取碱裂解法一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：培养细菌，使质粒DNA大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以

2、及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢

3、复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。二、仪器及试剂1.仪器及耗材：37恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。2.试剂及配制：LB培养液的配制：酵母浸提物 5.0 g；胰蛋白胨 10.0 g；NaCl 10.0 g；依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（约0.2 ml）调节培养液的pH值至7.0。再加去离子

4、水将溶液定容至总体积为1000 ml，10磅高压灭菌20 min，冷却后4保存。溶液 （GET缓冲液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖配制：1000 ml1 mol/L Tris-HCl（pH8.0） 25 ml0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 ml20% Glucose（1.11mol/L） 45 mldH2O 910ml将以上溶液混合装瓶， 10磅高压灭菌20 min，冷却后4保存。溶液II（变性液）：200 mmol/L NaOH ， 1% SDS配制： 500 ml 10% SDS 50

5、ml2N NaOH 50 ml取以上溶液，用灭菌去离子水定容至500 ml，充分混匀。室温保存，此溶液保存时间最好不超过一个月，最好现用现配。注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 溶液 III (醋酸钾液)：3 mol/L 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸配制：500 ml醋酸钾 147 g冰醋酸 57.5 ml加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至500 ml。高温高压灭菌后，4保存。10TE缓冲液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA配制：1000ml1 mol/LTri

6、s-HCl 缓冲液(pH 8.0) 100ml500 mmol/L EDTA (pH8.0) 20 ml加入约800 ml的去离子水，均匀混合。溶液定容至1 L。高温高压灭菌后，4保存。苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。其它试剂：TE（pH8.0）、异丙醇、氯仿/异戊醇（24:1）、无水乙醇、70乙醇、氨卞青霉素贮存液（50 mg/ml）三、操作步骤1.菌体的培养和收获 (1）将510 ml含有氨卞青霉素（AP）的LB培养基加入到容量为100ml

7、的三角瓶中，然后接入一单菌落，并保持通气良好，于37 220 rpm振摇过夜培养（约16h）后可以再转接一次，于37 220 rpm振摇培养34 h。 (2）吸取培养的菌液1.5 ml，转入1.5 ml的离心管中，用台式离心机以12000 rpm离心3 min。弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。2.质粒DNA提取（碱裂解法）（1）加100 ul 溶液 重悬细菌沉淀，用枪吹打直至混和均匀。（2）加200 ul溶液 ，盖紧管口，轻缓上下颠倒离心管以混合内容物。室温静置5 min（溶液变透明，粘稠）。（3）加150 ul溶液 ，轻微振荡混和10 sec，置冰上10 min (溶液出现白色沉淀)。（4）12000 rpm离心6 min，取上清液至另一离心管（弃沉淀）。（5）加等量的酚/氯仿/异戊醇，旋涡混匀1 min，12000 r/min离心6min，取上清液至另一离心管。（6）加1倍异丙醇，振荡混匀，静置10 min，12000 rpm离心6 min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。（7）加200 ul 70乙醇洗涤沉淀物，台式离心机12000 rpm离心2 min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在5060的烘箱中也可）。（8）沉淀加20l TE, 反复吹打使质粒DNA充分溶解，20保存。四、常见问题