结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

1、结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达【关键词】分枝杆菌,结核；Rv2389；基因表达nstrutinandexpressinfeukarytiexpressinvetrfybateriutuberulsisRv2389【Abstrat】AI:TnstruttheeukarytiexpressinvetrendingybateriutuberulsisRv2389andexpressitinHells.ETHDS:ThegeneendingRv2389prtEinereaplifiedbyplyerasehainreatinPRfrgenefybateriutuberulsisH

2、37Rvstrain.Aftersequened,Rv2389genesegentseresublnedinteukarytiexpressinvetrpDNA3.1(-).TherebinantplasidpDNARv2389eretransfetedintHellsithlipse.TheexpressinsfRNAandprteinendedbythisgeneeredetetedrespetivelyithRTPRandindiretiunfluresenttehnlgy.RESULTS:Rv2389aslnedintpDNA3.1(-)rretly,anditsexpressinat

3、RNAandprteinlevelsasdetetedinHells.NLUSIN:RebinanteukarytiplasidendingRv2389asnstrutedsuessfully.TheexperientestablishedthebasisfrfurtherstudynthefuntinfRv2389.【Keyrds】ybateriutuberulsis;Rv2389;geneexpressin【摘要】目的：构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法：PR扩增Rv2389基因，测序正确后克隆入真核表达载体pDNA3.1(-)，重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染H细

4、胞后,分别以RTPR方法检测RNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果：构建了重组质粒pDNARv2389，RTPR结果证明Rv2389可在H细胞中转录，间接免疫荧光检测证明，表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论：成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pDNARv2389，Rv2389基因可以在H细胞中表达.【关键词】分枝杆菌，结核；Rv2389；基因表达0引言结核病是目前危害全球人类安康的重要传染病.这主要是因为卡介苗BG对成年人结核病的预防效果不稳定，保护力为0%70%；没有特异性的诊断试剂；艾滋病等免疫缺陷个体的出现加快了本病的严重后果；耐药菌株的大量出现1.因

5、此寻找更有效的替代卡介苗的疫苗已成为当务之急.Rv2389蛋白是结核分枝杆菌ybateriutuberulsis,TB)复活促进因子resusitatinprtingfatr,Rpf样蛋白家族的一员，序列分析发现，它不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原2.为此，我们在Rv2389原核表达和纯化的根底上，构建了真核表达载体并在H(中国仓鼠卵巢)细胞中进展表达，同时从其表达程度和基因转录两方面进展鉴定，为其功能研究奠定根底.1材料和方法1.1材料TBH37Rv菌株,P815细胞由本室保存；真核表达载体pDNA3.1(-)由本室保存；含有Rv2389基因的重组质粒pPrEXH

6、TRv2389由本室构建保存；Rv2389蛋白多抗由本实验室制备；AV，RNA酶抑制剂和TRIzlPrega公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶和核酸分子质量标准品宝泰克公司；质粒提取试剂盒ega公司；梭华sft阳离子聚合物厦门太阳马公司；羊抗鼠荧光抗体宝信公司.1.2方法1.2.1Rv2389基因片段的扩增与测序结核分枝杆菌Rv2389全基因序列的特异性引物序列为：P1：5ggatgaatgagggtttgtta3，含BaH酶切位点，起始码和zak序列；P2：5gaagttatgttgtgatga3，含Hind酶切位点和终止码.PR反响条件：9440s，5630s，721in，共30个循环，

7、72延伸10in.回收PR产物，用T4连接酶将PR产物与pGETeasy载体连接，转化E.liDH5，随机挑取5个克隆提取质粒进展双酶切鉴定，取2个鉴定正确的克隆进展测序3.1.2.2重组质粒的构建及鉴定将测序正确的Rv2389基因克隆至真核表达载体pDNA3.1(-)，构建重组质粒pDNARv2389.连接转化、质粒提取均按文献进展3.以BaH和Hind酶切pDNARv2389，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒.1.2.3细胞转染将5105个H细胞接种于6孔板，细胞数量达孔底约2/3时进展转染.转染前用不含抗生素的1640培养液洗2次，以0.5L1640培养液重悬细胞.pDNARv238

8、9重组质粒10L和阳离子聚合物5L各用80L无血清的1640培养液稀释，两者混匀后室温作用20in，缓慢参加到细胞中.培养24h后搜集细胞，同时设正常细胞对照.1.2.4RTPR检测RNA表达搜集重组质粒转染的H细胞，2000r/in离心10in.参照Gib的TRIzl试剂盒说明书提取细胞RNA.在上述10LRNA溶液中，参加1Llig(dT)12-18引物，70水浴5in后立即置于冰上，加10buffer4L，gS44L，10l/LdNTPs2L，RNAinhibitr0.6L，AV0.8L，H210.4L.混匀，42作用1h，7015in终止反响.PR反响时参加DNA第1链2L，反响条件为

9、94预变性5in，94变性30s，55复性30s，72延伸40s，共进展30个循环，末次循环72延伸2in，扩增产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳检测.1.2.5间接免疫荧光检测目的基因表达将转染pDNARv2389质粒的H细胞爬片，用纯化的Rv2389交融蛋白制备的免疫血清作为一抗，间接免疫荧光法检测H细胞中交融蛋白的表达4.2结果2.1目的基因的扩增、克隆及酶切鉴定用PR方法从H37Rv中扩增出Rv2389的DNA片段，被顺利克隆入pGETeasy载体，测序证实所克隆的基因完全正确.序列分析与GenBank报道的一致图1.：DL2000arker；1：PR产物.图1Rv2389基因的PR结果略

10、2.2重组质粒的酶切鉴定重组质粒pDNARv2389被BaH和HindIII双酶切后可得到约475bp的片段，与预期的大小相一致图2.：DL2000arker;13：pDNARv2389被BaH和Hind双酶切.图2重组质粒的酶切鉴定略2.3RTPR检测RNA表达在约475bp处扩增出特异性基因图3，说明pDNARv2389重组质粒可以在H细胞中转录.：DL2000arker；1：RTPR产物.图3重组质粒转染H细胞的RTPR结果略2.4间接免疫荧光检测目的基因表达转染细胞在经过间接免疫荧光染色后，阳性细胞有较强的荧光着染，表达蛋白定位于细胞膜上，而对照组细胞没有着染图4.A：Rv2389交融

11、蛋白在H细胞内表达；B：对照.图4间接免疫荧光测定交融蛋白在H细胞中的表达400略3讨论ukalvaGV等5研究发现藤黄微球菌irusluteus,.luteus)可分泌一种Rpf，该因子可刺激该菌休眠体复活和生长，也可促进繁殖体生长，研究证实Rpf作用与真核细胞的细胞因子相似，具有自我刺激作用又称细菌因子.同时进一步研究证实该因子也可以刺激其他种类的高G+%的革兰阳性菌，包括结核分枝杆菌.结核分枝杆菌全基因序列分析说明，其中Rv1884；Rv2450，Rv0867，Rv1009，Rv2389和基因与luteus菌Rpf基因同源，其中4个基因编码的蛋白是分泌蛋白，推测结核杆菌这些基因编码的蛋白

12、可能也具有Rpf作用，但尚无直接证据5-6.Sassetti等7采用大规模插入突变分析发现Rpf样蛋白并不是H37Rv株生长所必需，而且这5种Rpf样蛋白在功能上有一定的重叠.因为突变Rv1009基因可明显减缓TB的生长速度，提示其在TB的生长中可能发挥着较为重要的作用.以往研究8说明，TBH37Rv株的几种Rpf样蛋白与luteus的Rpf蛋白一样，都属于膜蛋白，因此这些蛋白或者这些蛋白中的某个或某几个蛋白有可能会被宿主的免疫系统所识别，从而有可能作为亚单位疫苗的备选组分.近年来，国外在TB新型疫苗或增强BG免疫效果方面已作了大量的研究工作，并正在进展大规模的候选疫苗挑选工作.由于结核分枝杆

13、菌Rpf家族蛋白不仅可以促进结核休眠菌复活，而且还具有多种生物学活性如自溶素和/或青霉素结合蛋白的功能、细胞学方面的功能等9，此外这几种Rpf样蛋白与luteus的Rpf蛋白一样，都属于膜蛋白，因此这些蛋白或者这些蛋白中的某个或某几个蛋白有可能会被宿主的免疫系统所识别，从而有可能作为亚单位疫苗的备选组分.在本实验中，我们在Rv2389原核表达和纯化的工作根底上构建了真核表达载体并在H细胞中进展表达，同时从其表达程度和基因转录两方面进展鉴定，为其在新型疫苗的应用中奠定了根底.【参考文献】1KuarH,alhtraD,GsaiS,etal.Hfarhaveereahedintuberulsisva

14、inedevelpent?J.ritRevirbil,2022,29(4):297-312.2ukalvaGV,KaprelyantsAS,YungDI,eta.lAfailyfautrinegrthfatrsinybateriutuberulsisJ.lirbil,2002,46(3):623-635.3高雪，薛莹，姜泓，等.结核分枝杆菌furA基因片段的克垄表达和别离纯化J.第四军医大学学报,2022,2518：1637-1640.4师长宏，范雄林，徐志凯，等.交融表达Ag85BESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性J.第四军医大学学报,2022,252：121-124.5

15、ukalvaGV,KaprelyantsAS,YungDI,etal.AbaterialytkineJ.PrNatlAadSiUSA,1998,95(15):8916-8921.6artinG,NihlasHK,AngharadPD,etal.ResusitatinprtingfatrspssessalyszyelikedainJ.TrendsBiheSi,2022,29(1):7-10.7Sassetti,BydDH,RubinEJ.GenesrequiredfrybaterialgrthdefinedbyhighdensityutagenesisJ.lirbil,2022,48(1):77-86.8Tjalsa