登革病毒感染对人血管内皮细胞PGIS表达及PGI2分泌的影响

1、登革病毒感染对人血管内皮细胞PGIS表达及PGI2分泌的影响【关键词】登革病毒;,血管内皮细胞;,前列环素合酶;,前列环素EffetsfDenguevirusinfetinnPGISexpressinandPGI2seretinfhuanvasularendthelialellsAbstratAI:TeluidatetheeffetsfDenguevirusntheexpressinandseretinfprstaylin(PGI2)inendthelialells.ETHDS:ulturedhuanubilialvEinendthelialells(HUVE)ereinfetedbyDeng

2、uevirusIIDV2frdifferentduratin.PGI2levelinthesupernatantasdeterinedbyradiiuneassay.ytplasiRNAftheinfetedHUVEaspreparedusingtheTrizlethdandasassayedfrprstaylinsynthasePGISbyRTPR.RESULTS:PGISexpressinasellasPGI2seretinftheDV2gruperesignifiantlyinreased(P0.05)at48h,72hand96hpstinfetinparedtthentrlgrup.

3、NLUSIN:DV2uldprtetheexpressinfPGISRNAinHUVEandinreasethelevelfPGI2,hihayinreasethevasularpereability.ThedysfuntinfvasularendthelialellEinduedbyDVayberelatedtthepathgenesisfDenguehaerrhagifeverDHFandDengueshksyndreDSS.KeyrdsDenguevirus;vasularendthelialell;prstaylinsynthase;prstaylin摘要目的:研究登革病毒感染对人血管

4、内皮细胞分泌血管活性物质前列环素PGI2的影响,以理解登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)的发病机制。方法:用登革病毒型感染人脐静脉内皮细胞(HUVE),于感染后6、12、24、48、72、96h,分别搜集病毒感染的HUVE,用RTPR检测细胞内前列环素合酶PGISRNA的程度;分别搜集病毒感染的上清液,用放射免疫检测法测定PGI2的含量。结果:登革病毒感染可使PGISRNA的程度增高,导致HUVE分泌PGI2的量明显升高。在病毒感染后48、72、96h,与对照组比拟HUVE表达PGISRNA的程度和HUVE分泌PGI2的量明显升高(P0.05)。结论:DV2感染可显著上调HUVE中P

5、GISRNA转录及PGI2的分泌,导致登革病毒所致血管内皮细胞的功能障碍,可能与DHF/DSS的发病机制有关。关键词登革病毒;血管内皮细胞;前列环素合酶;前列环素登革热(Denguefever,DF)是由登革病毒(Denguevirus,DV)引起的急性感染性疾玻在大多数情况下,DF是自限性的,但假如开展成为登革出血热(Denguehaerrhagifever,DHF)或登革休克综合征(Dengueshksyndre,DSS)那么很危险。DHF/DSS最突出的特征是,血管渗漏、出血,系由于广泛的毛细血管浸透性增加所致。血管损伤确实切机制尚不完全清楚,但诸多研究显示与血管内皮细胞的构造和功能变化

6、亲密相关。在体外,DV可感染内皮细胞,使之释放多种血管活性物质1,2。研究说明,DHF患者在低血压危险期PGI2有过度升高的趋势。另外,血清中血栓素TXA/PGI的比值的下降程度也与登革病毒感染的严重程度相关3,4。但体外DV对内皮细胞分泌的血管活性物质PGI2的影响尚未见报道。本研究中应用DV2体外感染人脐静脉内皮细胞HUVE后,观察了DV对HUVE表达PGI2的影响。1材料和方法1.1材料DV2标准株(NeGuinea株,NG株)为本教研室冻存,采用微量病毒空斑法滴定,病毒的滴度为21010pfu/L。白蚊伊蚊(6/36)细胞株为本教研室长期传代和冻存。新生小牛血清购于杭州四季青生物公司。

7、RPI1640培养基、胰蛋白酶和Hepes均为Gib公司产品。K8为日本同仁化学研究所产品。Trizl购自上海申能博采公司。RTPR试剂盒为上海申能博采公司产品。PGI2和肌动蛋白A引物由北京赛百盛公司合成。6酮PGI放免试剂盒由北京解放军总院东亚免疫研究所提供。新生儿脐带由暨南大学第一附属医院妇产科提供。SAB免疫组化染色试剂盒为武汉博士德公司产品。鼠抗DV2IgG免疫血清为本教研室制备。FIT标记的羊抗鼠IgG为Siga公司产品。1.2方法1.2.1HUVE的培养按文献5建立的方法进展。取新生儿脐带用1.25g/L胰酶/0.1g/LEDTA消化液灌注消化法,从脐静脉中别离HUVE。离心沉淀

8、后,参加含200L/LFS的培养液(200L/LFS、RPI1640培养液、Hepes5g/L、L谷胺酰胺30g/L、青霉素1105U/L及链霉素100g/L),接种于252培养瓶中,在37、50L/L2培养箱内培养。3d后待细胞贴壁生长至集合状态,用1.25g/L胰酶/0.1g/LEDTA液消化传代。选择生长状态良好的第2、3代细胞进展实验。用免疫组化染色AB法检测胞质中第因子相关抗原的表达。1.2.2DV2对HUVE的感染性将HUVE接种到24孔板中,细胞密度为5107/L,每孔加1L,于37培养24h后感染病毒。每孔接种经预先滴定的约为5105pfu的DV2,使DV2的感染复数ultip

9、liityfinfetin,I为10pfu/细胞,于37吸附2h。弃感染上清,用含40L/L小牛血清的RPI1640培养液洗2遍,每孔参加该培养液0.5L,阴性对照孔中参加RPI1640培养液,于37、50L/L2培养箱中培养。分别搜集病毒感染后6、12、24、48、72和96h的HUVE,制成细胞抗原片,用间接免疫荧光法检测DV抗原阳性的HUVE。1.2.3细胞活力的检测将含有HUVE的培养液(1107细胞/L)分别参加5块96孔板中的24孔内,每孔100L,培养24h后感染病毒。每孔接种经预先滴定的约为1104pfu的DV2,使之I为10pfu/细胞,共接种12孔。对照组12孔接种含40L

10、/L小牛血清的RPI1640培养液,于37吸附2h。弃感染上清,用同一培养液洗3遍,每孔参加同一培养液100L。分别于培养6、12、24、48和72h,取出其中一块96孔板,于实验各孔中分别参加K8试剂10L,于37培养1h后,用BiRADdel450酶标仪于检测波长为450n参数波长为655n,测定吸光度(A)值。1.2.4DV对HUVE分泌PGI2的动态观察取培养24代的HUVE接种到24孔板中,细胞密度为5107/L,每孔加1L,于37培养24h。实验分组:实验组每孔接种经预先滴定的DV2约为5105pfu的DV2,使之I为10pfu/细胞,于37吸附2h。弃感染上清,用含40L/L小牛

11、血清的RPI1640培养液洗2遍,每孔参加同一培养液0.5L。对照组每孔加含40L/L小牛血清的RPI1640培养液。分别搜集培养6、12、24、48、72和96h实验组和对照组的培养上清。每次搜集4孔,-20保存,用特异性放射免疫法测定6酮前列腺素F16ketPGF1的含量,实验重复3次。1.2.5PGIRNA表达的RTPR检测以软件prier5.0设计扩增PGI2基因的引物,扩增片段长为310bp。上游引物的序列为:5AATGAAAAAGATGA3,下游引物为:5TTTAAGTGGTTGGAAA3。采用肌动蛋白A(atin基因)为内对照,扩增片段长为114bp,上游引物为:5AATGAAA

12、AAGATGA3,下游引物为:5ATTTAAATATGATG3。主要步骤包括:1总RNA提取:采用异硫氰酸胍酚氯仿一步法提龋分别搜集的6、12、24、48、72和96h实验组和对照组中培养细胞的总RNA。2逆转录反响(上海申能博采公司):总RNA4L、lig1dt18(50pl/L)1L及双蒸水7.5L,于70变性5in,0冰浴5in。参加RNA酶抑制剂0.5L、10pl/LdNTP2L、5扩增缓冲液4L、LV逆转录酶1L,使反响总体系为20L,于37温浴60in。再将反响混合物加热至95,5in。(3)PR反响:反响体系包括DNA2L、10pl/LdNTP0.5L、25pl/Lgl2L,10

13、扩增缓冲液2.5L、50pl/L上、下游引物各0.2L及TaqDNA聚合酶0.5L,加水至终体积为20L。首轮变性945in,后续变性9430s,退火6530s,延伸7290s,共30个循环,终末循环后于72延伸10in。(4)PR产物的半定量:取PR产物10L,进展在20g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外透视仪下检测所获条带,并进展吸光度扫描分析,结果以前列环素合酶PGISRNA扩增条带与atin基因的扩增条带的扫描峰面积比,表示PGISRNA的相对含量。1.2.6统计学处理所有数据均以xs表示,应用方差分析进展统计学检验各因素的作用效果,进一步应用独立样本t检验检验不同组别一样时段目的基因表达程度

14、的差异性,应用单因素方差分析检验DV2组不同时段时效变化的差异性。P0.05为具有统计学意义。2结果2.1HUVE的别离与鉴定所别离的HUVE在相差倒置显微镜下观察,细胞为单层鹅孵石状镶嵌排列。AB免疫组化染色法显示,细胞胞质中第因子相关抗原呈阳性,阳性的的黄色颗粒均匀地分布在整个细胞质,苏木素复染后,细胞核呈蓝色(图1),证明所别离的细胞为HUVE。间接免疫荧光法检测结果显示,感染后12h,开场出现荧光阳性的细胞,胞质及胞膜呈现微弱荧光(+),DV2特异性抗原在HUVE的胞质内呈灶性分布,24h后荧光增强,48h后最强,细胞胞质内出现片状或颗粒性黄绿色荧光(图2)。72h荧光开场减弱,96h

15、后荧光明显减弱。2.2DV2对HUVE活性的影响实验组细胞在培养的696h各个不同时段,应用K8所得的活力与对照组相比无统计学差异(P0.05),提示DV2对HUVE活力无影响。2.3登革病毒感染对HUVE分泌6ketPGF1的影响感染组和对照组的6ketPGF1分泌程度差异显著(P0.05)。独立样本t检验检测不同时段的差异性,在各时段DV组与对照组均有差异,提示DV感染可使HUVE分泌6ketPGF1的才能显著增加(表1)。感染后48、72及96h,分泌的6ketPGF1量与6、12、24h比拟差异显著(P0.05),提示DV感染后HUVE分泌6ketPGF1的才能有缓慢上升的趋势。对照组

16、6ketPGF1的分泌量各时间点差异无显著性。图1图2略表1DV2诱导的HUVE分泌6ketPGF1程度的变化略2.4DV2对HUVE的PGISRNA转录的影响对照组和DV2组均可扩增出相应目的基因片段,其PR产物经琼脂糖凝胶电泳证实,扩增的目的基因片段的大小较预期的结果相一致(图3、4)。应用图象分析处理系统进展灰度扫描,并进展扫描面积积分,比拟DV2组和对照组RTPR扩增的PGIS/atin目的DNA片段的灰度比值。重复测量的方差分析结果:P0.05;单因素方差分析DV2组不同时相间也有差异(P0.05),其中感染后48h与其他时间点均存在差异(均为P0.05),72及96h与其他时间点也

17、有差异P0.05。独立样本t检验检测不同时段的PGIS的RNA表达程度的差异性,在各时段DV2组与对照组差异均有统计学意义,提示DV2组PGIS的RNA表达程度高于对照组。DV2组PGISRNA的表达程度在感染48h后显著升高;在感染96h内不同时相均高于对照组(表2)。图3扩增的目的基因PR产物的琼脂糖凝胶电泳分析略表2DV2诱导的HUVE表达PGIS/atinRNA程度的变化略3讨论近年来,DV屡次在东南亚地区爆发,是这些地区儿童的主要死亡因素之一。DHF/DSS主要临床表现为血浆的渗漏和出血,当出现血容量减少性休克时6,7,如不及时治疗可危及生命。血管内皮细胞是DV感染的靶细胞,存在多种

18、途径参与DHF/DSS的发玻DV感染可以使血管内皮细胞分泌的多种因子,如IL6,IL88,T,tPA等1发生紊乱,进而影响血管内环境的稳态。说明血管内皮细胞受累是DHF/DSS的发病过程中一个极其重要的因素。本研究首先应用K8检测了DV2对HUVE的毒性并对其增殖进展分析,该法的灵敏度和精细度远高于TT法9。结果显示,DV2(I=10)感染HUVE前后与对照相比,其反响产生的甲染料(Frazandye)在450n的A值虽有升高的趋势,但均没有统计学差异,提示DV2感染对HUVE的活性无明显影响。血管内皮细胞通过调节部分凝血/抗凝血机制的动态平衡,以保持血液的正常流动状态。最近研究1,10证实,

19、血管内皮细胞在DV感染过程中分泌与凝血和纤溶相关的分子失调。在部分的抗凝机制中,内皮细胞所合成和分泌的(PGI2)起着非常重要的作用,其参与了部分抗凝、扩张血管等生理和病理过程。PGI2是具有生理活性的花生四烯酸代谢产物,在磷脂酶A2的作用下,细胞膜内磷脂裂解为花生四烯酸,经环氧化酶途径氧化,生成前列腺素G2PGG2。PGG2可经氧化酶作用形成前列腺素H2PGH2,PGH2的活性极不稳定,于内皮细胞内,在PGIS的作用下可形成PGI2。PGI2是迄今发现的作用最强的内源性血小板聚集抑制剂,比腺苷的作用强1000倍,并有较强的舒张血管、增加血管通透性的作用。在体内低浓度的PGI2可抑制由腺苷二磷

20、酸(ADP)形成的微血管栓塞。PGI2通过与细胞膜上的相应受体相结合,可激活腺苷酸环化酶,使胞内的环腺苷酸(AP)含量升高,发挥其松弛平滑肌细胞和抑制血小板聚集的作用。Preeyasnbat等3,4的临床研究发现,DHF患者尤其是在有低血压休克危险时,血清中的PGI2有过分升高的趋势。在另一个研究中,他们发现血清中PGI2的平衡因子TXA2在有低血压休克危险时降低,提示当TXA2不能完全代偿PGI2的升高时,患者更易发生休克的危险。研究还发现TXA2/PGI2的重要意义:二者比值的降低提示临床表现更加严重。此种作用是DV的单独作用还是一些细胞因子的作用,或者是病毒与细胞因子的协同作用至今尚未说

21、明。由于PGI2在内皮细胞抗凝机制中发挥着重要的作用,而DHF/DSS患者又表现出明显的凝血障碍性出血倾向,我们通过体外实验,检测DV2感染的内皮细胞对PGIS的合成及PGI2的分泌的影响,以初步反映病毒感染对内皮细胞抗凝功能的影响。由于PGI2不稳定,最终变成稳定的产物6KetPGF1,目前一般以测定6KetPGF1的浓度代表PGI2的浓度。本实验中发现,DV2感染后,血管内皮细胞中6ketPGF1的合成和分泌明显增高,并且随着时间推移有相应增加的趋势。为了进一步研究PGI2升高的机制,同时对PGI2合成的关键酶PGIS进展了研究,发现PGIS的RNA程度在48h开场有明显的升高,96h到达

22、最高。以上实验说明,DV2感染HUVE,可导致内皮细胞分泌PGIS的功能在转录程度受到一定的影响,从而影响PGI2的分泌量。这种改变具有一定的时间效应关系。本实验的结果与临床报道3,4的结果相吻合。可部分地解释临床DHF/DSS患者血浆中PGI2升高的现象。本实验结果说明,DV感染可增加血管内皮细胞PGISRNA转录程度表达及血管活性物质PGI2的分泌,导致血管通透性增加和凝血、止血功能障碍,可能是DHF/DSS的重要的发病机制。当然,血管内皮细胞内环境的稳态涉及到多种分子复杂的调控,包括促进血栓形成的因素和抗凝因素的平衡系统和调控系统等,显然对单一分子的研究还不能完全说明问题,但为进一步的研究提供了一定的实验资料。参考文献:1江振友,肖瑞,唐小龙,等.登革2型病毒调控血管内皮细胞纤溶系统相关蛋白的表达J.中华微生物学和免疫学杂志,2022,25(7):523-528.2江振友,江丽芳,郭辉玉.白细胞介素6在登革热病毒感染人脐静脉内皮细胞中的作用J.中国人兽共患病杂志,1997,131:3-6.3Preeyasbat,BunnagP,SirinavinS,etal.Plasaprstaylin(PGI2)indengueherrhagifeverJ.SutheastAsianJTrpedPubliHealth,1990,21(3):383-387.4Pr