常用分子生物学技术课件

1、哈尔滨医科大学药学院生物制药教研室第六章 常用分子生物学技术第一节 分子杂交技术 分子杂交技术：是利用单链核酸碱基互补配对，抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋白质检测的技术。分子杂交技术检测方法探针标记物一、同位素（如32P、35S等）二、荧光基团三、发光基团四、生物素五、地高辛一、Southern印迹二、Northern印迹三、Western印迹四、原位杂交五、生物芯片学习内容Southern印迹：是将DNA片断从电泳凝胶上直接转移至膜支持物（如硝酸纤维素膜、尼龙膜）上，固定DNA片段，并用标记的探针进行杂交，以检测目的DNA的技术。现已成为基因组DNA特异序列

2、定位、检测目标DNA的通用方法。一、Southern印迹Edwin Mellor SouthernDNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹法碱液（NaOH）在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。主要用于分析基因的转录或mRNA分子的大小。二、Northern印迹Northern印迹法 Western blot 又称蛋白质印迹法，是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或

3、生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。三、Western印迹Western Blot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western-blot有何应用呢？检测样品中特异蛋白存在与否细胞中特异蛋白的半定量分析蛋白质分子相互作用的研究DNA重组技术siRNA的转染技术表观遗传学（甲基化，miRNA）凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到western blot技术能做什么？Western Blot 流程蛋白样品的制备SDS转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色收集蛋白样品使用

4、适当的裂解液，如RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。测定蛋白样品的的蛋白浓度。2.SDS电泳氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 E凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212 作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O灌制浓缩胶 插入梳子 3.转膜原理：蛋白

5、因结合SDS而带电荷，转膜即在电 场作用下蛋白质从胶中转至膜上的过程。转膜 半干转湿 转半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD的蛋白两种方法的转膜液不同！方法 仪器 特点转膜准备转膜 制作“三明治”转 膜 转膜条件：推荐：100V ，12小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。转膜 转膜后检测：（立春红染色） 为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。1x立春红5min染色前染色后转 膜 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）West

6、ern Blot 膜封闭液（生物试剂公司）4.封 闭 5.免疫反应,显色一抗、二抗孵育分子生物学中使用的标记方法原位杂交：将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。四、原位杂交五、生物芯片生物芯片是将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等做成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子列阵，然后与待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现高效、快速、高通量样品检测。“人类基因组计划”的迫切需求： 30亿个碱基对、10万个基因的信息分析理想的解决方案 生物芯片：新的快速价廉的基因测序和功能研究方法1

7、992年第一张基因芯片此后系列生物芯片相继问世生物芯片的发展历史生物芯片研究学科的紧密交叉分子生物学生物信息学医 学药 物 学化 学材 料 学微 流体力学微 电 子 学物 理 学高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。自动化：降低成本，保证质量。生物芯片的特点生物芯片的分类基因芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是基于核酸、探针互补杂交技术的原理，将大量的寡核苷酸片段按预先涉及的排列方式固定在载体表面

8、如硅片或玻璃片上，并以此为探针，在一定的条件下与样品中待测的靶基因片段或DNA序列杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来实现对靶序列信息的快速检测和分析基因芯片（DNA微阵列）基因芯片荧光标记的样品 共聚焦显微镜获取荧光图象杂交结果分析探 针 设 计杂交基因芯片原理基因芯片技术主要步骤芯片制备把探针固定于载体表面样品制备目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析探针的设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于芯片上的探针。探针在芯片上的布局：选择合适的方式将探针排布在芯片上。1、芯片制备原位合成法：采用光刻原位化学合成技术，在玻片、硅片等载体表面合成寡核酸探针点阵。该方法适用于商品化、规模化高密度

9、基因芯片制备。点样法：利用手工或自动点样装置将寡核苷酸链探针、cDNA或基因组DNA点在经特殊处理的载体上，包括接触法和喷墨法两种，适用于自行制备点阵规模适中的基因芯片。基因芯片的制备方法生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的DNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。2、样品制备样品的分离纯化DNA , mRNA扩增PCR, RTPCR，固相PCR标记等过程荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标记杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选

10、择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。3、杂交反应4、结果分析芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后，或与标记的靶抗原或抗体结合后，可采用下列方法分析处理数据：共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针合成较复杂。化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。 芯片扫读装置根据采用的光电偶合器件，分为光电倍增管型和CCD型。根据激光光源，可分为激光型和非激光。应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好的定位功能，可定量，应用广泛。基因芯片技术

11、在医学中的应用基因表达分析 基因型、基因突变和多态性分析 疾病诊断：遗传性、感染性、肿瘤 药物筛选 指导用药及治疗方案 预防医学 蛋白质芯片蛋白质芯片也称蛋白质微阵列（protein microarray）,是将已知多肽、蛋白质固定于硅片、玻片等支持介质上，支撑高密度的多肽分子或蛋白质分子的微阵列，利用抗原与抗体、受体与配体、酶与底物、蛋白质与其它小分子之间的相互作用，检测分析多肽、蛋白质的一项技术。根据制作方法和应用的不同，蛋白质芯片分为两种：蛋白质功能芯片：研究蛋白质间、蛋白质修饰、 DNA- 蛋白质间、 RNA- 蛋白质间、蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子蛋白质等相互作用的芯

12、片。它是将所研究体系中的每种天然蛋白质点加在基片上制成芯片 , 用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量平行研究。 蛋白质检测芯片：蛋白质检测芯片是将具有高度亲和特异性的探针分子 固定在基片上 , 用以识别复杂生物样品溶液 ( 如细胞提取物 ) 中的目标多肽 , 当放射性同位素或荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后 , 通过激光共聚焦扫描或电荷耦合检测装置 (CCD) 对信号的强度进行检测 , 从而判断样品中靶分子的数量。 蛋白质芯片技术技术主要步骤提出生物学问题（实验目的）样品预处理（重组蛋白，制备一、二级抗体，荧光标记，配蛋白印记缓冲液）生化反应化学偶合，加底物，反应温度和时间，冲洗条件

13、检测（荧光和比色扫描或拍照，参数设置）数据分析（图象量化，标准化，采集蛋白信息，建立模型）12345蛋白质芯片制备6蛋白质芯片的应用疾病诊断和预警药物开发 蛋白质的筛选及研究定量检测组织提取液中的肿瘤标记物Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 14271436.孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原微阵列方法与ELISA方法检出结果比较疾病诊断uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子VEGT 血管内皮生长因子 人动脉平滑肌细胞蛋白谱Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 12741280.蛋白质组学揭示了oxidized low density l