农杆菌介导法

1、菌在C下培养。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌放入和液启体培养基中（加有农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究AHighlyEfficientAgrobacterium-mediatedRiceTransformationMethod水稻是基因组研究的模式植物,近年来水稻基因组研究取得了很大进展,构建了遗传图谱和物理图谱,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2-序3以,及第1号和第4号染色体的精细测4-序5并,对第10号染色体的结构进行了详细分析。在此基础上各,实验室大规模地,系统地进行水稻功能基因研究普遍采用的研究手段是基因标签技术。基因标签技术包括和转座子标签创建大量的基因标签体是功能基因研究的

2、材料平台。而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之。本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法以创期为水稻功能基因研究提供丰富材料为水稻重要菌在C下培养。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌放入和液启体培养基中（加有菌在C下培养。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌放入和液启体培养基中（加有农艺性状的改良开辟途径。1材料以水稻品种日本晴载体为增强子捕获载体见图列和潮霉素选择标记基因G农杆菌菌株为为试验材料。菌株类型为超毒力菌株载体上带有报告基因、的启动子序菌在C下培养。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌放入和液启体培养基中（加有菌在C下培养。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌放入和液启体培养基

3、中（加有圈L载体pFX-E24.2-15R的T-DMA片段圈i.k:KB沟TDb肌右边界一GA/VP16沟酵劭转汆通、祸CM.1DMA紬汨乂5单观利崗VP16激活|的融宀垦凶忌3.为6牛重复的上游激活序列-BoGLS曲细蘭QZ葡（葡）IT带酸覘M圉.Cut35S花椰病毒肆別P.mrG足逸择杯记垒凶一LB是T*DNA左边界*方法水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照等。将日本晴水稻种子去壳用再用的次氯酸钠灭菌处理不同时间灭菌后用无菌水冲洗次于固体培养基上养创得到胚性愈伤组织。农杆菌转化愈伤组织用固体培养基氯霉素和以确定最佳灭菌时间C避光培养后将愈伤组织进行继代培利福平培养农杆乙醇%灭菌脯氨酸C下摇荡培养

4、。将挑好的胚性愈伤组织放入锥形瓶菌液倒入另一锥形瓶中并加入培养基分别调节值至不同数值211、以确定最佳的发杆菌浓度。然后将菌液倒入愈伤组织中用手轻摇感染。再吸干菌液将愈伤组织放入装有滤纸的培养皿中干燥移至共培养基上C下共培养。转化体的获得将共培养的愈伤组织转出无菌水漂洗次再用培养基头抱霉素在室温下摇洗洗遍后吸干放在滤纸上。将吸干的愈伤组织转入选择培养基上潮霉素头抱霉素C下暗培养后继代一次。将新长出的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上C下暗培养。将抗性愈伤组织转移到分化培养基上下光照培养周后新鲜愈伤组织将有绿点出现每周继代一次待分化出完整小苗后转入壮苗培养基中。炼苗并移栽。染色分析参照的方法切取代

5、转化体的叶片、种子等器官进行染色在C下反应弃去染色液用的酒精脱色在解剖显微镜下观察拍照。染色液组成为的磷酸钠盐缓冲液的铁氰化钾亚铁氰化钾甲醇结果与分析.不1同灭菌时间对愈伤诱导率的影响灭菌是转化成功的关键技术之一既用要保证灭菌彻底用又不能影响种子萌发和产生愈伤。用次氯酸钠对粒种子分别处理、和结果表明随着灭菌时间的增加愈伤诱导率呈下降趋势。灭菌时愈伤诱导率仅为大部分种子不能萌发周,推测可能是胚已被到灭菌效果周次氯酸钠对种子萌发无影响周,种子萌发力强周但是由于萌发消耗了很多养分周反而部分抑制了愈伤组织的生长周故其愈伤诱导率为96.反周而%低于灭菌代周时的愈伤诱导率.而且灭菌和时形成的愈伤颗粒比较小

6、侵染时易于褐死不利于转化而灭菌时的愈伤颗粒大小在左右适合于转化且诱导率最高。因此次氯酸钠的最适灭菌时间为霉.愈2伤组织的继代培养时间对转化率的影响愈伤组织经过多代培养后会用产生体细胞突变用不利于转化体的筛选。同时用多代培养后愈用伤组织逐渐衰老死亡将用大大降低转化效率。但是传统的方法直接用诱导的愈伤来转化用也会降低转化效率这用可能是细胞的周期状态影响了转化效率有用报道认为当愈伤组织细胞处于细胞周期时期和周期的比例高时转化效率最高而且期是细胞复制期此时转化有利于链转变成双链增加稳定整合和遗传。所以经过适当的继代培养可以使细胞处于转化最佳状态而提高转化效率。本实验通过观察经用继代培养后的愈伤组织表面

7、光滑用质地致密用粒形好用继代培养时转化率最高。培养时间太短愈伤组织表面粗糙粒小不利于转化培养时间过长则愈伤组织变软,发粘,转化后易褐化死亡。3.农3杆菌浓度对转化效率的影响农杆菌浓度直接影响到转化效率。农杆菌浓度太低时愈每个愈伤组织块产生的抗性愈伤数极少愈大部分不产生抗性愈伤;浓度太高则愈愈伤组织很容易被过度侵染愈共培养后无法恢复活力在进行选择培养时大多数会褐化死亡。本研究用不同值的农杆菌菌液分别处理生长状况良好一致的个愈伤组织发现当值为时转化效率基本保持在左右当值低于时转化率较低超过时愈伤死亡数量增多并且选择培养时因过多的农杆菌覆盖在抗性愈伤组织上愈抑制了其生长。4结论与讨论农杆菌转化效率的

8、影响因子包括菌株类型、水稻基因类型、培养基成分组成、组织培养条件等。笔者通过对日本晴水稻转化条件的研究发现在日本晴的转化过程中当种子灭菌时愈伤的诱导率最高继代培养后的转化率最高菌浓度值为时转化效率高。另外试验还发现在分化培养时黑暗条件下预培养的可以大大减少愈伤组织的褐化程度分化效率达到85。%优化后转化体系大大减少了组织培养时间转3个月即可获得转化植株不转但节省成本转而且减少由于组培而激活等水稻内源转座子从而造成体细胞突变的频率。农杆菌介导的基因转化技术已经很成熟但是要适应高通量的水稻基因组研究快速完成插入饱和突变体的创制转需要大大提高抗性愈伤组织的分化效率。传统转化技术将转化后的愈伤组织直接放在同一培养基上进行分化与选择培养转容易造成愈伤组织因褐化而抑制分化。因为选择培养基中含有的高浓度抗生素使未转化的愈伤组织褐化而产生酚类等有毒物质抑转制了抗性愈伤组织的生长和分化。有人对传统转化方法进行初步改进把转抗性愈伤组织单独放在含有抗生素的分化培养基上培养但转是由于抗生素的影响以及分化培养基中的等见光分解结果直接影响了分化效果。笔者在此基础上做了进一步的改进将选择培养基上的抗性愈伤组织转到分化培养基上然后放置在黑暗下培养再转到新的分化培养基上光照下培养只需左右就能分化成苗分化效率可达。该方法的优点在于使在黑暗下充分发挥作用转促使愈伤组织很