实用可行性高蛋白质的测定氨基酸的测定

1、第九章 蛋白质和氨基酸的测定第一节 概述 第二节 蛋白质的测定方法 第三节 氨基酸态氮的测定 1第一节 概述一、pro组成与蛋白质系数1组成 pro是由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物。元素组成百分比：元素 C H O N S P百分比 50 7 23 16 0-3 0-322蛋白质系数 蛋白质系数即1份氮素相当于蛋白质的量。 一般蛋白质含氮量为16，即1份氮素相当于6.25份蛋白质 。二、氨基酸的组成 是由脂肪酸碳链上的氢原子被NH2所置换而得到的。三、pro变性 引起pro变性的因素主要是热、酸和碱，化学试剂、重金属盐等。 pro 发生变性作用后，溶解度降低，发生凝结，形成不可逆

2、凝胶，-SH暴露在外面。3四、测定意义1. 蛋白质的测定意义(1) 蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标。 (2) 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。 2. 氨基酸的测定意义 (1) 了解食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成；(2) 指导食品加工工艺的改革、保健食品的开发及合理配膳。 4第二节 蛋白质的测定方法一、凯氏定氮法 （一）常量凯氏定氮法：1原理 常量凯氏定氮法是利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化使蛋白质分解，其中C、H形成CO2及H2O逸去，而

3、氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。将消化液碱化，蒸溜，使氨游离，随水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用盐酸标准液滴定所生成的硼酸铵、从消耗盐酸标准溶液的量计算出总氮量。 5(1) 消化 (2) 蒸馏： (3) 吸收与滴定： 62适用范围此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。3. 仪器 凯氏烧瓶(500mL)、定氮球、漏斗、冷凝管、锥形瓶、滴定管。 74. 试剂(1) 浓硫酸(2) 硫酸钾：提高溶液的沸点，加快有机物的分解。H2SO4和K2SO4的添加量 1g样品 K2SO4：H2SO4=7g：12mL (3) 硫酸铜：起催化作用，加速氧化分解；也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量不足，分

4、解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀。(4) 40%氢氧化钠8(5) 混合指示剂 甲基红溴甲酚绿混合指示剂： 5份2g/L溴甲酚绿95乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙醇溶液混合均匀。终点为灰红色。 或甲基红亚甲蓝混合指示剂： 一体积的亚甲蓝（0.05%酒精溶液）和二体积的甲基红指示剂（0.05%酒精溶液）的混合物。终点为紫色。 (6) 饱和硼酸溶液（40g/L）： 称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。 (7) 0.1N盐酸标准溶液95. 测定方法 (1) 样品消化： 准确称取约相当于30-40mg氮的样品干燥的凯氏烧瓶加入 0.5g研细的硫酸铜、3g硫酸钾及20ml浓硫酸消化至溶液透明呈蓝绿

5、色继续加热0.5h 10(2) 蒸馏、吸收： 装好蒸馏装置冷凝管下端浸入接收瓶液面之下凯氏烧瓶内加入100mL蒸馏水、玻璃珠数粒加入70ml400g/L氢氧化钠直火加热蒸馏30min 将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏lmin，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏 11(3) 滴定：将接收瓶内的硼酸液用0.lmolL盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白 6. 结果计算：式中 w蛋白质的质量分数，%； c 盐酸标准液的浓度，molL； V1空白滴定消耗标准液量，ml； V2试样滴定消耗标准液量，ml； m样品质量，g：0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol； F蛋白质系数。12（二）微量凯氏定氮法原理 2

6、. 仪器 (1) 100ml凯氏烧瓶(2) 微量凯氏定氮器 (1) 100ml凯氏烧瓶(2) 微量凯氏定氮器13143. 试剂(1) 40g/L硼酸溶液。(2) 400g/L氢氧化钠。(3) 1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1:5混合。(4) 0.0100mol/L盐酸标准溶液。(5) 其他试剂同常量法。154. 测定方法 样品消化步骤同常量法。 将冷却后消化液转入l00ml容量瓶定容至刻度，摇匀装好微量定氮装置移取消化稀释液10ml于反应管内加入l0ml40氢氧化钠溶液进行水蒸汽蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10分钟后，将冷凝管尖端提离液面

7、再蒸馏lmin，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。 馏出液用0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。同时作一空白试验。5结果计算16（三）半微量凯氏定氮法： 1原理2试剂3. 仪器： (1) 100毫升凯氏烧瓶(2) 半微量凯氏定氮装置 17184. 操作方法 样品消化步骤同常量法。 将冷却后消化液转入l00ml容量瓶定容至刻度，摇匀装好半微量定氮装置移取消化稀释液25ml于反应管内加入l0ml40氢氧化钠溶液进行水蒸汽蒸馏至馏出液50毫升左右（连吸收液共60毫升左右）即可。 馏出液用0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。同时作一空白试验。5结果计算：19第三

8、节 氨基酸态氮的测定 一、双指示剂甲醛滴定法1原理 双指示剂甲醛滴定法是利用氨基酸含有氨基及羧基这两性基团，他们相互作用而形成中性的内盐，加入甲醛与氨基起反应而使羧基游离出来，显示出酸性，再用氢氧化钠标准溶液滴定羧基，间接求出氨基酸态氮的量。其反应方程式如下： 202试剂(1) 200g/L中性甲醛溶液（用百里酚酞作指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠滴定至呈淡蓝色）。(2) 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。(3) 1g/L百里酚酞95（体积分数）乙醇溶液。(4) 1g/L中性红50%（体积分数）乙醇溶液。 213. 测定方法 移取含氨基酸约20mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，

9、加50ml水，其中l份加3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠滴定至琥珀色为终点，另一份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛10ml，摇匀，静置1min，用0.1mol/L氢氧化钠滴定至淡蓝色为终点。记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。224结果计算式中 w氨基酸态氮的质量分数； C氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； V1用中性红作指示剂滴定消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml； V2用百里酚酞作指示剂滴定消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol m 测定用样品溶液相当于样品的质量，g。 23二、电位滴定法1原理 此法是利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱

10、性，使羧基显示出酸性，将酸度计的甘汞电极及玻璃电极插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，根据酸度计指示pH值控制终点。2试剂(1) 200h/L中性甲醛溶液（用百里酚酞作指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠滴定至呈淡蓝色）。(2) 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液。 243仪器(1) 酸度计。(2)磁力搅拌器。(3)10ml微量滴定管。254测定方法(1) 吸取含氨基酸约 20mg的样品溶液，于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.00ml。置于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准

11、溶液毫升数，可计算总酸含量。(2) 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。(3）取80ml水先用0.05molL氢氧化钠调至pH为8.2，再加入10.00rnl甲醛溶液，用0.05molL氢氧化钠滴定至pH8.2，做试剂空白试验。265结果计算 式中w氨基酸态氮的质量分数，； V1测定样品稀释液加入甲醛后消耗标准碱液的体积，ml； V2测定空白加入甲醛后消耗标准碱液的体积，ml； C氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol m 测定用样品溶液相当于样品的质量，g。 27思考题：1为什么说用凯氏定氮法测定出食品中的蛋白质