-高效液相色谱法

1、高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography （HPLC）1一、前言 HPLC是70年代以后发展最快的一个分析化学分支，现已成为生化、医学、药物临床、化学化工、食品卫生、环保检测等领域最常用的分离分析手段。我国：2课时安排：第一章：高效液相色谱的基本原理 6学时第二章：高效液相色谱的仪器装置 2学时第三章：液固、液液、键合相色谱 4学时第四章：离子交换色谱和离子对色谱 3学时 第五章：凝胶渗透色谱 1学时第六章：实验技术和辅助实验技术 2学时机动 2学时3实验安排：实验一：样品保留值的重复性测定实验二：流动相极性变化对溶质保留值的影响实验三：试样中

2、苯甲酸的定性分析4参考书籍：1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）2.高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著）3.高效液相色谱方法及应用 （色谱技术丛书、化学工业出版社、 于世林编著)5第一章、高效液相色谱的基本原理1-1 概述一、发展历史1903年提出、19691970年开始发展流动相液体基本原理：在经典液相色谱基础上，引入 气相色谱理论技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化678 工作原理： 通过高压泵，连续地将流动相按一定流速流过柱子；通过进样器，注入样品混合物。由于混合物中各组分性质不同，因而它们在柱内移动速度不同而逐渐分离。通过检测器检测

3、，得到组分的电信号并进行放大；记录仪将放大的电信号以图形形式记录下来。 9高效液相色谱法特点：1.高压：一般：150300kg/cm2 甚至：500kg/cm22.高速：两相间交换：千分之几秒 分析时间较经典法少很多(几分几十分钟)3 高效：气相：2000塔板/米 液相：5000塔板/米4.高灵敏度：紫外检测器：109g数量级 荧光检测器：1011g(百万分之几） 试样量小（几微升）5.高选择性：可分析在性质上极为相似化合物 （手性化合物、同位素、同分异构、空间异构） 10与气相色谱比较：相同点：都是重要的分离、分析手段 气相的基本理论（塔板理论、定性定量方法） 基本术语（色谱参数、色谱图、色

4、谱柱效）不同点：应用范围：气相：易挥发、热稳定 液相：不易挥发、热不稳定但具有一定 溶解性化合物，不适合气体。流动相作用：气相：运载样品，不影响色谱分离 液相：运载样品，参与、影响色谱分离， 且起主要作用。分析样品：气相：破坏样品，不能回收。 液相：不破坏样品，能回收。说明：11 HPLC的分类： 液固吸附色谱（LSC) （ 利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离） 液液分配色谱（LLC）（利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度不同而分离） （键合相色谱 60） 离子交换色谱（IEC）（利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固定相的亲合力不同而分离） 体积排阻色谱（SEC)（利用溶质分

5、子大小不同导致对固定相的渗透力不同而分离）121-2 色谱分离和保留值一、色谱过程定义由于样品中各组分在不互溶的两相间平衡 分配的不同，在色谱柱中进行分离的过程 固定相：柱中固定不动 移动相：流过柱子的液体综合来看：不同组分分离状况取决于：热力学平衡问题：各组分分配系数、吸附力、亲 合力之间差异影响出峰时间动力学平衡问题：溶质扩散系数、填料颗粒、填 充情况、流速影响峰形13色谱过程特点：组分经无数次平衡分配后，在柱的流 出液中浓度对分离时间呈高斯曲线型色谱条件一定时，各组分都有特定时 间在图谱中出现，称为保留时间tR。柱效一定时，保留值越小，峰窄；保 留值越大，峰宽。相邻峰间tR相差越大，组分

6、间越易分 离14二、容量因子和保留值 色谱的保留作用化合物进入柱内，即在两相间不断进行平衡分配，由于不同化合物理化性质不同，在两相中存在量也不同。固定相中量多，柱内保留时间长；流动相中量多，柱内保留时间短。15容量因子k某一组分平衡时，两相中存在量的比值。要得到理想分离， k应保持在110之间 k太小没有充分利用填料 的分离能力。 k太大分析时间太长。1613色谱柱的分离效率分离过程基本理论：各组分在两相间分配情况：tR由色谱过程的热力学因素所控制各组分在色谱柱中的运动情况：Y1/2由色谱过程的动力学因素所控制17一、理论塔板数N二、理论塔板高度H三、峰扩展和速率方程式峰扩展某一组分流过时，经

7、过多次平衡分配，使开始处于“浓缩”状态的组分被移动相稀释，最后得到有一定宽度的色谱峰，称之。柱外因素：检测器流动池体积 柱出口到检测器的连接管 进样器死体积18柱内峰扩展影响因素：涡流扩散减小措施：颗粒大小保持一致 填装均匀 尽量采用球型填料涡流扩散随柱长增加而增加，与流动相流速无关。分子扩散减小措施：加大流动相流速19传质溶质分子在两相间浓度的不同，从浓度高的相，不断迁移至浓度低的相，直到浓度达到平衡，这种质量迁移过程称之。固定相传质：固相固定相 液相固定相移动相传质：迁移移动相 滞留移动相20获得高柱效的几种方法：选用细的颗粒填料流动相流速低流动相粘度小升高温度溶质扩散系数与其结构有关大分

8、子，扩散系数小小分子，扩散系数大212214 分离度 Rs（Resolution)一、分离度影响因素峰的宽度（峰宽越小， Rs越大） 峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学特性两峰的保留时间之差（tR越大， Rs越大） 反映了色谱分离的热力学特性二、控制分离度方法改变k更换色谱柱（改变N）改变选择性系数三、分离度控制的一般原则23第二章 仪器装置液相色谱仪可分为四大系统： 泵系统 进样系统 分离系统 检测系统 2421 泵系统作用：向色谱柱输送一个连续、恒定的移 动相。一、对泵系统的要求1.使用方便（易调节流量、过压保护等）2.更换洗脱液容易、死体积小3.有最大工作压力4.一定流量范围（0.110

9、ml/min)5.流量稳定性好6.流量精度高25泵系统26泵系统发展趋势高效：填料颗粒分离效率 柱压降泵的工作压力分析时间短：更快流速柱压降减少洗脱液用量液相色谱的多元洗脱系统2722 分离系统（色谱柱）组成：精密管径的不锈钢管、填料、柱接头要求：柱管内壁非常光滑 柱接头设计要保证系统中引入最小 死体积 能密封高压液体 两端加过滤片28柱效的影响因素填料的颗粒度及其均匀性柱长、填装的方法与技巧常用：内径25mm（4.6mm)柱效一定时，柱长与颗粒度成正比例如：颗粒度510um、柱长1530cm 颗粒度35um、 柱长7.515cm29进样系统302-3 检测系统功能：连续地将色谱柱中流出的组分

10、随时间 变化的情况，转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中，得到色谱图。按检测方式不同，分为：总体性质检测器（通用型） 示差折射检测器、电导检测器溶质性质检测器（选择型） 紫外检测器、荧光检测器31一、检测器的性能指标一个理想检测器，必须具备下列条件：灵敏度高不受温度及流动相流速变化的影响响应随组分量的变化而线性地变化稳定性好，操作方便32性能指标：灵敏度 S=R/Q最小检测限（检测下限）线性范围检测信号呈线性变化时，最 大和最小进样量之比噪音在没有样品情况下，检测器输出 的最大振幅漂移检测器在一段时间内，基线随时 间的增加而产生的偏离33检测系统34紫外检测器优点：灵敏度高（1010g/ml

11、)对梯度洗脱是一种理想检测器局限性：不能检测对紫外光没有吸收的样品不能使用对紫外光有吸收的溶剂35PAD检测器36第三章、液固色谱、液液色谱、键合相色谱31 液固吸附色谱一、原理: 固定相是极性吸附剂，由于不同官能 团样品具有不同极性，因而对固定相的吸 附能力不同。极性越大，吸附能力强；极 性越低，吸附能力越弱而导致分离。37分离对象：官能团有差别的不同类型化合物几何异构体（由于固定相表面是刚性结构，即吸附中心处于吸附剂表面一定位置上。溶质分子官能团与吸附中心的相互作用随分子的几何形状而改变，当官能团与吸附中心对准，作用就强。）38二、填料的类型及其选择按形状分：a. 球形 b. 无定形按多孔

12、程度分：a. 多孔型 b. 薄壳型按极性分：a. 极性 b.非极性三、硅胶的活性控制及标准化市售未处理硅胶加热46小时，活化去水。再加进定量水分，使吸附剂含水量保持恒定。39四、吸附强度分类根据化合物结构类型，可将它们在硅胶上 的吸附强度排序：P186归纳：官能团不同极性不同吸附强度不同几何异构体空间位置不同吸附强度不同40五、流动相选择的实用要求溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性避免使用与固定相发生不可逆反应溶剂流动相应与检测器相匹配使用的溶剂应当易于除去，不干扰对分离组分的回收41LSC流动相分类根据所起作用分为：底剂 洗脱剂根据氢键、酸碱性基团分类：无氢键型 斥电子氢键

13、型吸电子氢键型 具斥、吸电子双重性的氢键型 酸类 碱类42LSC流动相的选择流动相作用：把吸附剂吸附的溶质洗脱下来溶剂强度。洗脱能力k 溶剂强度参数。序列：P174混合溶剂优点：获得最佳分离选择性移动相粘度低4332 液液分配色谱和键合相色谱一、液液分配色谱（LLC)定义以一种液体作固定相，它均匀 地涂敷在大小一致的小颗粒惰性 担体上。另一种液体作移动相。涂 敷在担体上的固定相应与移动相 极性有很大差别，即两者不相溶。441. 原理：溶质分子X在固、液两相中存在分配平衡KXS/Xm，不同的溶质在两相中有不同的分配系数K，因而在两相中有不同的溶解度。在固定相中溶解度大，tR；在移动相中溶解度大，

14、 tR。452. 固定相要求：溶质在固定相中溶解度大于移动相防止固定相流失很重要，采取措施：移动相使用前，先预饱和。避免使用对固定相有中等溶解度的移动相整个色谱体系的稳度必须恒定注意配制样品溶液的溶剂特性46注意点：对有不同长度侧链的多环芳烃，宜用反相色谱分离。在相同条件下，流动相组分变化对有取代基的多环芳烃的保留影响较大。3.流动相选择对固定相无损害不宜采用梯度洗脱常见：乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷47二、键合相色谱定义固定相通过某种化学反应将有机分 子以共价键结合在色谱担体的表面， 这种色谱类型称之。制备硅胶基质化学键合固定相，注意：键合反应前，将硅胶表面硅氧烷全部水 解为硅烷醇。除去

15、硅胶表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。48形成化学键合固定相，必须具备条件： 所用基质材料应有某种化学反应活性 有能与基质表面发生化学反应的官能 团键合相反应类型：P303目前最广泛采用的化学键合固定相：硅烷化合物（存在Si-C键）使反相色谱的应用范围远远超过正相色谱49反相色谱的保留机理疏溶剂理论双保留机理分离对象：同系物：烷烃数tR 直链tR支链tR化合物极性 tR固定相对组分保留的影响：碳链长度：碳链 tR烷基覆盖量：覆盖量 tR50反相色谱中流动相选择水有机改善剂常用：甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环极性：有机改善剂水洗脱能力：有机改善剂水极性顺序：甲醇乙腈二氧六环四氢呋喃洗脱顺序：

16、水甲醇乙腈二氧六环四氢 呋喃51反相键合相色谱的优点流动相可选用水溶性 .样品的溶解度范围提高 .流动相可变性大 .柱重现性好固定相表面化学能低 .平衡容易 .梯度洗脱固定相选择多固定相耐溶剂冲洗 热稳定性好52缺点：流动相PH范围要控制（PH28） PH太低：Si-C键易断裂 PH太高：硅胶基质易溶解游离的硅羟残基影响分离 53色谱选择性解析熟练应用HPLC技术仔细研究和解析大量色谱图找出固定相溶质移动相三者间相关规律。通过解析，可以得到：未知化合物极性大小溶解度参数 空间位置阻碍等方面知识1.色谱分离选择性的物理概念色谱系统的物理化学参数固定相的表面化学性质 流动相性质和浓度温度54 分子

17、间作用力有三种： 定向作用力（取向力） 极化作用力（诱导力） 分散作用力（色散力）影响氢键大小因素：随与H相结合的原子电负性的降低而降低只有电负性较强的原子才可与X-H形成氢键氢键形成难易与空间位阻有关55第四章 离子交换色谱、离子对色谱41 离子交换色谱一、原理： 以离子交换剂为固定相，与流动相中离子 型物质发生可逆的离子交换，根据溶质离 子、离子交换固定相、流动相离子之间相 互作用力的差异而导致色谱分离。56二、离子交换剂常见：硅胶为基体的键合相离子交换剂PH对交换容量的影响：强酸、强碱性离子交换剂，交换性能不受PH影响，交换容量恒定。弱酸性阳离子交换剂，在较高PH条件下 弱碱性阴离子交换

18、剂，在较低PH条件下 发生离子交换57三、离子交换色谱的影响因素流动相PH的影响流动相中反离子的形式和浓度 三者相互作用力关系：.溶质对B+的亲合力交换能力tR.流动相离子对B+亲合力洗脱能力 tR有机溶剂影响5842 离子对色谱离子抑制法通过控制PH，可以控制离子浓度，从而实现在反相柱上对弱酸、弱碱的保留，达到分离目的。一、原理 色谱过程中，溶质离子X和带相反电荷 的配对离子Y-（固、液相中）相结合形 成离子对化合物X+Y-，然后在两相中分 配。59二、正相离子对色谱 常见：固定相：吸附在硅胶担体上的水 （含配对离子） 流动相：有机溶剂三、反相离子对色谱常见：固定相：化学键合相 流动相：缓冲

19、溶液（含配对离子） 有机改善剂离子对试剂选择：酸性物质阳离子配对离子（四丁基胺等）碱性物质阴离子配对离子（烷基磺酸盐）60三、反相离子对色谱的应用1.分析无机离子a.无机阴离子 b.金属离子络合物2.在生物医学分析中应用a.分析测定核苷酸、核苷、碱基b.分析测定维生素c.分析测定生物碱61四、影响离子对色谱分离选择性因素1.溶剂极性的影响正相：极性洗脱强度 k反相：极性有机溶剂比例洗脱强度 k 2.离子强度的影响反相:水溶液中离子强度 洗脱能力 k3.PH值的影响弱酸：PH值接近7组分完全电离最易形成离子 对k最大 PHX-HX 固定相中离子对减少 k 一般：PH=27.4 PH8 硅胶溶解

20、624.离子对试剂性质和浓度的影响正相:离子对试剂烷基链疏水性缔 合物k反相：离子对试剂烷基链疏水性 缔合物k无机盐离子对试剂疏水性减少缔合物k离子对试剂浓度：10-410-2mol/L5.温度的影响机械涂敷型固定相：不采用梯度洗脱，恒温反相离子对色谱：流动相粘度大, 温度柱效63第五章、体积排阻色谱51 分离机理固定相一定孔径大小范围的多孔填料小分子完全进入填料小孔中 （完全渗透）大分子完全不能进入填料小孔中 （完全排除）中间尺寸分子部分进入填料小孔中 （选择性渗透）64排阻色谱特点：a.样品峰全部在溶剂的保留时间前洗脱b.柱内的峰扩展较小c.峰较窄，有利于检测d.采用示差检测器不足：a.峰

21、容量小 b.不能分离大小相似、分子量接近的 组分6552 柱填料、移动相 柱填料要求：a.含大小一定孔径的多孔填料b.多孔表面不应有吸附作用，只存在排除机理分类：1.有机凝胶（交联的聚苯乙烯） 半刚性填料，孔径范围较宽，分离范 围较大。非极性有机溶剂，脂溶性样品 2.无机凝胶（多孔硅胶） 柱效高、分离度好。柱压低，更换溶剂 时，平衡较快。但易拖尾。66凝胶的选择渗透极限可以分离的最高分子量 （与孔径有关，孔径大，渗透 极限大）分离范围校正曲线的线性部分 67移动相选择a.能溶解样品b.不应造成填料太大的溶胀或收缩c.控制PH和离子强度，可消除非排除机理的影响（离子强度0.050.1 常用磷酸盐

22、或硫酸盐 PH接近中性为宜）d.尽量降低溶剂粘度（加电介质）e.选择与样品折射率差别大的溶剂，提高灵敏度样品浓度：0.010.5%常用：甲苯、苯、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、四氢呋 喃、水溶液68HPLC 分离类型的选择根据试样的化学物理性质进行选择应掌握各分离类型特点、机理、选择方法每一种分离形式中都可能参与另一种分离形式，仅仅主次之分不同主要根据试样的分子量大小、化学结构、溶 解度参数等化学物理性质来确定69a.已知结构试样查阅文献资料以其他色谱分离技术作参考b.分子量较大（M2000）蛋白质、高聚物体积排阻色谱c.分子量较小（ M2000）试样多种溶剂中溶解度情况决定分离类型、填

23、料、流动相由于试样组分的复杂性，还需对试样的来源、性质等作详细了解，以作选择参考。70第六章、实验技术和辅助实验技术61 定性和定量分析一、定性分析利用保留值定性a.与标准物对照 b.将标准物加入样品中c.二极管阵列检测器联机定性收集洗脱液后定性分析 71二、定量分析标准曲线法（外标法）归一化法（所有组分都出峰）内标法（选取内标物）标准加入法（加入标准样品，利用加入 前后峰面积变化计算）72三、影响定量分析结果准确度因素样品制备a. 样品溶剂与洗脱液互溶性好b. 将干扰组分尽可能分离c.含量低时必须富集回收率试验：标准物加入已知含量被测样 品中用制备样品同样方法处理定量 测定，得回收率。回收率

24、（测定值样品值）/加入量73 储存条件：低温、干燥、避光 样品制备包括：a.溶解（超声波、离心） b.浓缩 c. 萃取 d.预分离 e.衍生化进样技术影响因素：a.进样装置的准确度和精度 b.分析人员对进样技术的熟练程度进样六通进样阀（定量进样管34倍）定量方法选择a.Rs1.5，柱效变化时，采用峰面积定量。b.流速变化时，外标法不适用（峰面积影响大）74定量分析不宜采用梯度洗脱（基线易漂移）检测器特性稳定性和线性范围直接影响定量准确性a.被测组分浓度和响应值呈线性关系b.进样量不能超出线性范围7562 HPLC实验技术一、色谱柱的保养新柱要作净化处理平时使用：a.正式进样前，先用流动相冲平衡

25、b.一种流动相换另一种时，需互溶柱的储存：储存于相对惰性溶剂中（反相柱用甲醇）对复杂样品或易污染样品，应装预柱实验结束，当洗脱液用缓冲液时，水冲洗甲醇保护76二、流动相的处理流动相的脱气原因：a.高柱压下流动相中空气，会在柱 的洗脱 液流中形成气泡，干扰检测器信号。 b.除去氧（氧易与固、流反应，不利于柱 稳定）脱气方法：a.真空脱气法 b.惰性气体吹脱法 c.超声波脱气法77流动相的纯化a.将溶剂通过干燥的多孔硅胶漏斗（0.45)b.在进样器之前设置预柱，将杂质吸附掉流动相配制a.先配制再脱气，或先脱气再配制b.对含量少的溶剂必须用移液管精确量取c.如用缓冲液，浓度应尽量低些 （0.001mol/L）78三、样品的预处理目的：除去微粒 减少