基因操作原理04课件

1、第四章 大分子的分离和分析一、E.coli质粒DNA的分离和纯化1质粒DNA的小量提取第一节 DNA的分离、检测和纯化1质粒DNA的小量提取 步骤性原理 在碱性条件下，线状DNA变性，质粒DNA维持环状，高盐条件下复性，除质粒DNA外，形成沉淀。 步骤 细菌培养物的生长、时间、量 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化（苯酚/氯仿 梯度离心）Sol I Tris-HCl, EDTA, Glucose Sol II NaOH-SDSSol III 3M KAc DNA purification Kit (QiaGen)二、DNA的电泳检测主要检测：分子量，含量及有无1. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖 从海藻

2、中提取的一种线状高聚物常规熔点低熔点 Gelling point 25 20-30 Melting point 65 电压 迁移率与电压成正比 2kb 应 5 U/cm 电场方向 单一方向 负 正 脉冲电场 几百kb以上 温度 4-30， 0.5% or 低熔点 4 buffer TAE TBE TPE 50mM (pH7.58.0) 碱性agarose电泳 用于分析 ssDNA/Southern 杂交 londing buff 溴酚蓝/二甲苯菁FF 40% Sucrose 染色/摄影 EBt 0.5g/ml 10mg/ml store (棕色瓶or铅铂纸) UV 波长：长366nm, 短25

3、4, 一般3022. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）优点: 分离率高 1 bp, 点样量高 10g 回收的DNA纯度高非变性: 迁移率与序列和组成有关变性(尿素/甲醛): 无关，分离探针，S1酸产物分析，DNA测序三、DNA片段的纯化（从agarose）1.低熔点agarose电泳 gel + 5vol tris 65 5min phenol extract ethanol2.透析袋，电洗脱法 可用于5kb3.Glass Milk (bead) 3M NaI 溶液，bead吸附 洗涤 elute4.Kit Qiagen 公司一个典型哺乳动物细胞约含 10-5g RNA，其中80-85%为rRN

4、A(28S,18S和5S/23S,16S,5S)三种类型)，其余1520%主要由各种类型的低分子量RNA组成（如tRNA，核内小分子RNA等）。mRNA为总RNA的15%，3端有一个poly(A)尾，可与oligo(dT)-纤维素，吸附，亲和层析分离寡脱氧胸苷酸。第二节 RNA的分离、纯化和检测一、注意事项控制RNA酶的活性(一) 实验用具和溶液的去RNA酶处理1. 玻璃制品、塑料制品、电泳槽一次性使用用品/第一次使用的用具，可稍作处理器皿：180 8hr or longer， 氯仿冲洗/NaOH/专用溶液 0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)、浸泡(37，2hr) (RNA酶的强列抑制剂，但不

5、绝对) 无菌水(or DEPC水)洗涤 100烤15min湿热灭菌电泳槽: 洗净,水冲洗, 乙醇干燥 3%H2O2 10min 0.1% DEPC H2O 水洗2H2O：0.1% DEPC 溶液：用DEPC水配制 （注意有些药品，不能用DEPC,如Tris）3其它 如手套，保持干净、清洁（二）RNA酶抑制剂1蛋白质抑制剂 人胎盘RNase抑制剂2氧铜核糖核苷复合物 100%抑制（且抑制体外翻译）3硅藻土，吸附RNase二、RNA的抽提1文献法2Kit Gibco/TR1ZOL Reagent 100ml 99.8USD 酚+异硫氰酸胍 Qiagen/RNAeasy三、纯化1蛋白质的去除（见上）

6、2DNA的去除 DNase I （RNase free） inhibitor3Kit4梯度离心四、mRNA的纯化1亲和层析2纯度检测 OD260: 1=40g/ml RNA五、电泳1琼脂糖凝胶 氢氧化甲基汞 甲醛 乙二醛-二甲基亚矾（DMSO）2PAGE1检测蛋白质分子量2Western blot3N-torminal amino acid sequence第三节 蛋白质的SDS第四节 分子杂交 molecular hybridization1. 根据被杂交的对象分为Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque)2.denature变性：热，极端pH，

7、有机溶剂，尿素 annealing复性： 互补单链重新配对恢复成双链为复性 hybridization杂交： 同源单链重新配对恢复成双链为杂性一、Southern blot(一)DNA片段的转移1酶切2电泳/照相中性碱性（0.4N, NaOH）3. 变性/中和 大片段 脱嘌呤 0.2N, HCl 10min 0.5N NaOH/1.5M NaCl 1M Tris(pH7.4)/1.5M NaCl4. 转移 Nitrocellulose membrane NC nylon membrane (charged or not) 6SSC (or SSPE)转移 buffer 毛细管 电转移 真空滤纸

8、凝胶滤膜吸水纸玻璃板重物支持物500g时间: 1kb 15kb 18hr5固定 80 2hr, UV, microwave(二) 杂交 hybridization1. 预杂交prehybridization6SSCDenhardt(50 x)：(含Ficoll,聚乙烯比咯烷酮)变性鱼精DNA0.5% SDS其他预杂交液: 脱脂牛奶 ExpressHyb (Clontech公司) (1-2 Hr) 2. 杂交 探针处理 温度 42 50%甲酰胺 时间 6-8小时 探针：DNA, Oligo, 随机DNA3. 洗膜 2SSC/0.5% SDS 15min RT 0.1SSC/0.5 % SDS 1

9、hr at 杂交温度（三）检测 X-film or 生化 Phosphor image（四）探针的标记 probe labeling1均一标记 切口平移nick traslation: E.coli DNA polyI 随机引物 random primer: 6Nt or 612nt klenow 2单链探针 ssDNA模板，通用引物，合成ssDNA探针 RNA探针，RNA polymerase3末端标记 Klenow 标记3端, 补平和置换反应 T4 polymerase 标记3端 3-5外物活性强，特别适用于3突出末端 Kinase 标记5端 正反应 32P5-OH NNNN5pNNNN

10、交换反应 过量ATP 使5-PADP then 32P5 末端转移酶标记34寡核苷酸 Kinase 末端转移酶5标记物 放射性: 32P，33P，35S 非放射性: DIGoxigenin Biotin 标记 dUTP(五) DIG标记/检测举例1.探针标记6 Nt随机寡核序列苷酸引物, Klenow标记2检测 漂洗 blocking 免疫反应 labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗涤 显色反应 化学发光检测 NBT-BCIP 形成棕黄色沉淀BCIP：5-溴-4-氯-3吲哚磷酸NBT: 氯化硝基四氮唑蓝（染料色素） CIP的底物, 也称氮蓝四唑优点：无污染，方便，探针可重复使用，可控

11、制显色反应，保存杂交膜，易辩别真假阳性缺点：灵敏度不够，不能多次杂交， 只有0.1pg可检测单拷贝，如g人胎盘DNA中的单拷贝二、原位杂交 菌落杂交和空斑杂交1. 菌落生长 点种: 将阳性重组子二个平板上(有/无膜) 加CK 影印: 菌落和空斑，绝大多数应为重组子(白色菌落)2DNA的释放与固定 有多种方法 10%SDS； 0.5N NaOH/1.5N NaCl 0.5M Tris 1.5N NaCl SSC 干燥 固定 80 2hr三、斑点杂交类似上述方法，直接将DNA样品点在杂交膜上。四、Northern blot 类似于Southern blot但用于检测RNA的分子杂交技术,用于分析总

12、RNA或 mRNA。1电泳缓冲液 甲醛buf (5) 0.1mM MOPS(pH2.0) (3-(N-玛琳代)丙磺酸) 40mM NaAc 5mM EDTA(pH8.0) DEPC H2O 制胶 甲醇（MW 30.03）通常为37%水溶液，12.3M（pH4.0） 终浓度，1buf + 2.2M甲醇2上样 预处理 RNA（up to 30g）4.5l+5buf 2.0l 甲醛 3.5l 甲酰胺 10l 65 15min loading buf 50% 甘油，1mM EDTA(pH8.0) 0.25% BPB 0.255二甲苯TFF3电泳 loading 之前，预电泳5min 5V/cm 电泳1

13、2hr后，混合正负极电泳液4转膜预处理 DEPC H2O洗涤去除甲醛 if agarose10% or 厚度0.5cm or 2.5kb 需用0.05M NaOH 处理20min,部分水解RNA 无RNase H2O洗涤, 20SSC 浸泡45min 转移, 同Southern五、Western blot基本原理同其它 blot方式, 检测蛋白质与Southern的关键区别在于探针性质: 抗体(一) 抗体的要求1单克隆抗体 但并非都适合，由于靶蛋白已变性。2多克隆抗体抗体为混合物，对其特异性,亲和力及浓度都一无所知对由SDS/还原剂变性处理的目标蛋白是否还能识别应做预备实验(二) 简要步骤1样品制备 SDS样品2running SDS3蛋白质转移 硝酸纤维素滤膜，电转移:三夹板/隔离电极板 干燥4染色 丽春红S or 印度墨水（射启性检测适用） 但现少采用，由于有prestain MW marker5封闭背景 脱脂奶粉 5%6第一抗体与靶蛋白结合7二级免疫反应 抗免疫球蛋白抗体 或 A蛋白A蛋白可与IgG的Fc片段binding木瓜蛋白酶切割IgG Fragment antigen binding, Fragment crystalline 标记：125I 碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶 偶联8检测辣根（HRP