广谱高效微生物防腐剂 产生菌的筛选及应用

1、 学校代码10463 密 级 硕 士 学 位 论 文广谱高效微生物防腐剂产生菌的筛选及应用作者姓名 指导教师 教授 副教授学科门类 理 学学科专业 微生物学培养单位 生物工程学院完成时间 二一三年五月Screening of Broad-spectrum Biocontrol Substance Producing Strain and Application A Dissertation Submitted for the Degree of MasterCandidate：Supervisor：Prof. Associate Prof. College of BioengineeringH

2、enan University of Technology, Zhengzhou, China关于学位论文的独创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致谢外，本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得河南工业大学或其它教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对研究所做的任何贡献均已在论文中做出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文使用授权书本人完全同意河南工业大学有权使用本学位论

3、文（包括但不限于其印刷版和电子版），使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门（机构）送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、借阅和复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，采用影印、缩印或其他复制手段保存学位论文。保密学位论文在解密后的使用授权同上。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日指导教师签名： 日期： 年 月 日PAGE III摘 要微生物导致食品的腐败变质不仅会造成巨大经济损失，还会引起严重的食品安全问题。而现有的食品防腐保鲜方法在实际生产应用中具有一定的局限性，迫切需要寻求更安全有效的防腐保鲜新技术，将微生物及其代谢产物应

4、用于食品防腐保鲜的生物防治方法是现阶段研究的热点。从轮马热泉、北海温泉、大塘热泉等腾冲温泉附近采集土壤样品23种，采用稀释分离法分离纯化得到细菌菌株142株。以大肠杆菌、黑曲霉、禾谷镰刀菌等为指示菌，采用滤纸片法或平板对峙法从142株细菌菌株中初步筛选得到具有广谱抑菌效果的菌株7株，其中菌株 LM2303广谱抑菌效果最好。通过形态特征分析、生理生化特性分析和16S rDNA序列比对，菌株LM2303应为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。采用紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变和微波诱变对菌株LM2303进行选育。其中，经硫酸二乙酯诱变处理得到突变菌株D59，其抑菌效果较原始菌株提高了1

5、1.4%。以抑菌物质产量为指标，从8种基础培养基中筛选出菌株D59最佳发酵培养基M2。采用单因素实验和响应面分析对菌株D59进行发酵条件优化。单因素试验结果表明培养时间、温度和转速对菌株D59抑菌物质产量有显著影响(p0.05)。利用响应面确定菌株D59的最佳培养条件为：接种量5%、装液量100mL/250mL、培养时间43h、温度33、转速177rpm。在上述发酵条件下培养，100mL发酵液可得到抑菌物质粗提物2.8560 g(湿重)，是原发酵条件下的1.4倍，有效提高了抑菌物质产量。采用盐酸沉淀、甲醇萃取，从拮抗菌株发酵液中得到抑菌物质粗提物。利用薄层色谱对抑菌物质进行分析和初步纯化，紫外

6、及茚三酮显色结果表明抑菌物质含有苯环和闭合肽键。红外光谱扫描结果表明菌株LM2303抑菌物质为环状脂肽类物质。该脂肽类物质理化性质稳定，抑菌谱广，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌和黑曲霉、黄曲霉、扩展青霉、禾谷镰刀菌等真菌均有较强的抑制作用。从不同腐烂病症的冬枣上分离得到根菌索菌、细极链格孢、橄榄色盾壳霉、扩展青霉四种致腐真菌。平板对峙试验结果表明菌株LM2303可有效抑制上述四种真菌的生长，菌株LM2303具有冬枣贮藏期致腐真菌的生物防控应用潜力。关键词：枯草芽孢杆菌；拮抗；抑菌物质；诱变选育；发酵条件优化PAGE VIIPAGE VIABSTRACTFood spoilage caused

7、 by pathogenic microorganisms not only results in great financial losses, but also serious food safety problems. And existing food antisepsis method in practical application has certain limitations, to explore an obvious safe and effective anticorrosion technology is particularly important. Microorg

8、anisms and their metabolites work for food conservation is a research focus of biological control HYPERLINK app:ds:at at HYPERLINK app:ds:the the HYPERLINK app:ds:present present HYPERLINK app:ds:stage stage.142 strains of bacteria were isolated from 23 soil samples which collected form Tengchong HY

9、PERLINK app:ds:hot spring t _self hot spring, such as Lun-ma HYPERLINK app:ds:hot spring t _self hot spring, Bei-hai HYPERLINK app:ds:hot spring t _self hot spring, Da-tang HYPERLINK app:ds:hot spring t _self hot spring and so on. HYPERLINK app:ds:filtering Filtering HYPERLINK app:ds:paper paper HYP

10、ERLINK app:ds:method method and dual culture technique were employed to test antagonistic effect of bacteria strains, and seven of them showed efficient inhibitory, strain LM2303 has the most obvious inhibitory effect. Strain LM2303 was identified as Bacillus subtilis through the analyses of morphol

11、ogical and biochemical properties and 16S rDNA sequencing.Bacillus subtilis LM2303 was used as the start strain and the mutation breeding was carried out through UV light, DES and microwave radiation. Inhibition ratio of strain D59 isolated following DES mutagenesis enhance 11.4%. The production of

12、biocontrol bubstance was taken as indexes, M2 medium was used for fermentation screened from 8 different medium. The factors and its levels influencing the production of biocontrol bubstance produced by strain D59, was determined by using single-factor test, and the optimization of fermentation cond

13、itions was approached by RSM. The optimum fermentation conditions were as follows: temperature was 32.6, inoculation was 5%, medium volume was 100mL/250mL, rotary speed was 176.9 rpm and fermentation time was 43.02 h. Under the new fermentation condition, 2.8560 g biocontrol bubstance can be obtaine

14、d from 100 mL fermentation broth and is the 1.4 times of original fermentation conditions. Biocontrol bubstance were obtained with hydrochloric acid precipitate and methanol extraction method from fermentation broth, and purified by thin layer chromatography. Purified biocontrol bubstance was detect

15、ed by FT-IR. The results showed that the biocontrol bubstance contained lipopeptides. Biocontrol bubstance produced by strain LM2303 has stable physical and chemical properties and wide antibacterial spectrum, exhibit strong inhibitory effect on a number of bacteria and multiple pathogenic fungi.Fou

16、r putrefying fungi were isolated from the decayed tissues of Winter Jujube and identified as Rhizomorpha Roth.ex Fr, Alternaria tenuissima, Coniothyrium olivaceum and Penicillium expansum. Strain LM2303s prominent inhibition on four putrefying fungi lay the foundation for putrefying fungi biocontrol

17、 of Winter Jujube.Key words: Bacillus subtilis; antagonistic action; biocontrol bubstance; mutation breeding; optimization of fermentation conditions目 录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc355292525 第一章 前言 PAGEREF _Toc355292525 h 1HYPERLINK l _Toc355292526 1.1 研究背景 PAGEREF _Toc355292526 h 1HYPERLINK l _

18、Toc355292527 1.2 生防微生物概况 PAGEREF _Toc355292527 h 2HYPERLINK l _Toc355292528 1.2.1 用于生物防治的微生物种类 PAGEREF _Toc355292528 h 2HYPERLINK l _Toc355292529 1.2.2 生防微生物的作用机制 PAGEREF _Toc355292529 h 2HYPERLINK l _Toc355292530 1.3 生防芽孢杆菌 PAGEREF _Toc355292530 h 4HYPERLINK l _Toc355292531 1.4 芽孢杆菌抑菌物质研究概况 PAGEREF

19、 _Toc355292531 h 4HYPERLINK l _Toc355292532 1.5 本研究的目的和意义 PAGEREF _Toc355292532 h 6HYPERLINK l _Toc355292533 第二章 广谱拮抗菌株的筛选及其鉴定 PAGEREF _Toc355292533 h 8HYPERLINK l _Toc355292534 2.1 材料 PAGEREF _Toc355292534 h 8HYPERLINK l _Toc355292535 2.1.1 样品 PAGEREF _Toc355292535 h 8HYPERLINK l _Toc355292536 2.1.

20、2 试剂 PAGEREF _Toc355292536 h 9HYPERLINK l _Toc355292537 2.1.3 仪器 PAGEREF _Toc355292537 h 10HYPERLINK l _Toc355292538 2.1.4 培养基 PAGEREF _Toc355292538 h 10HYPERLINK l _Toc355292539 2.1.5 供试有害微生物 PAGEREF _Toc355292539 h 11HYPERLINK l _Toc355292540 2.2 方法 PAGEREF _Toc355292540 h 11HYPERLINK l _Toc355292

21、541 2.2.1 微生物培养 PAGEREF _Toc355292541 h 11HYPERLINK l _Toc355292542 2.2.2 细菌菌株分离纯化 PAGEREF _Toc355292542 h 11HYPERLINK l _Toc355292543 2.2.3 菌悬液制备 PAGEREF _Toc355292543 h 11HYPERLINK l _Toc355292544 2.2.4 拮抗菌株初筛 PAGEREF _Toc355292544 h 12HYPERLINK l _Toc355292545 2.2.5 拮抗菌株无细胞培养滤液制备 PAGEREF _Toc3552

22、92545 h 12HYPERLINK l _Toc355292546 2.2.6 拮抗菌株的复筛 PAGEREF _Toc355292546 h 12HYPERLINK l _Toc355292547 2.2.7 拮抗菌株形态特征观察 PAGEREF _Toc355292547 h 13HYPERLINK l _Toc355292548 2.2.8 拮抗菌株生理生化特性分析 PAGEREF _Toc355292548 h 13HYPERLINK l _Toc355292549 2.2.9 拮抗菌株16S rDNA序列分析 PAGEREF _Toc355292549 h 13HYPERLINK

23、 l _Toc355292550 2.3 结果与分析 PAGEREF _Toc355292550 h 14HYPERLINK l _Toc355292551 2.3.1 细菌菌株的分离纯化 PAGEREF _Toc355292551 h 14HYPERLINK l _Toc355292552 2.3.2 拮抗菌株初筛 PAGEREF _Toc355292552 h 15HYPERLINK l _Toc355292553 2.3.3 拮抗菌株复筛 PAGEREF _Toc355292553 h 15HYPERLINK l _Toc355292554 2.3.4 拮抗菌株LM2303鉴定结果 PA

24、GEREF _Toc355292554 h 17HYPERLINK l _Toc355292555 2.4 结论与讨论 PAGEREF _Toc355292555 h 19HYPERLINK l _Toc355292556 第三章 菌株LM2303诱变选育 PAGEREF _Toc355292556 h 21HYPERLINK l _Toc355292557 3.1 材料 PAGEREF _Toc355292557 h 21HYPERLINK l _Toc355292558 3.1.1 微生物菌株 PAGEREF _Toc355292558 h 21HYPERLINK l _Toc355292

25、559 3.1.2 试剂 PAGEREF _Toc355292559 h 21HYPERLINK l _Toc355292560 3.1.3 培养基 PAGEREF _Toc355292560 h 21HYPERLINK l _Toc355292561 3.1.4 仪器设备 PAGEREF _Toc355292561 h 22HYPERLINK l _Toc355292562 3.2 方法 PAGEREF _Toc355292562 h 22HYPERLINK l _Toc355292563 3.2.1 菌悬液制备 PAGEREF _Toc355292563 h 22HYPERLINK l _

26、Toc355292564 3.2.2 紫外线诱变 PAGEREF _Toc355292564 h 22HYPERLINK l _Toc355292565 3.2.3 硫酸二乙酯(DES)诱变 PAGEREF _Toc355292565 h 22HYPERLINK l _Toc355292566 3.2.4 微波诱变 PAGEREF _Toc355292566 h 23HYPERLINK l _Toc355292567 3.2.5 正突变株筛选 PAGEREF _Toc355292567 h 23HYPERLINK l _Toc355292568 3.2.6 突变株遗传稳定性 PAGEREF _

27、Toc355292568 h 24HYPERLINK l _Toc355292569 3.3 结果与分析 PAGEREF _Toc355292569 h 24HYPERLINK l _Toc355292570 3.3.1 紫外线(UV)诱变 PAGEREF _Toc355292570 h 24HYPERLINK l _Toc355292571 3.3.2 硫酸二乙酯(DES)诱变 PAGEREF _Toc355292571 h 25HYPERLINK l _Toc355292572 3.3.3 微波诱变 PAGEREF _Toc355292572 h 26HYPERLINK l _Toc355

28、292573 3.3.4 突变菌株的遗传稳定性 PAGEREF _Toc355292573 h 27HYPERLINK l _Toc355292574 3.4 结论与讨论 PAGEREF _Toc355292574 h 27HYPERLINK l _Toc355292575 第四章 拮抗菌株发酵条件优化 PAGEREF _Toc355292575 h 29HYPERLINK l _Toc355292576 4.1 材料 PAGEREF _Toc355292576 h 29HYPERLINK l _Toc355292577 4.1.1 微生物菌株 PAGEREF _Toc355292577 h

29、29HYPERLINK l _Toc355292578 4.1.2 试剂 PAGEREF _Toc355292578 h 29HYPERLINK l _Toc355292579 4.1.3 仪器 PAGEREF _Toc355292579 h 30HYPERLINK l _Toc355292580 4.1.4 培养基 PAGEREF _Toc355292580 h 30HYPERLINK l _Toc355292581 4.2 方法 PAGEREF _Toc355292581 h 31HYPERLINK l _Toc355292582 4.2.1 种子液制备 PAGEREF _Toc35529

30、2582 h 31HYPERLINK l _Toc355292583 4.2.2 生物量测定 PAGEREF _Toc355292583 h 31HYPERLINK l _Toc355292584 4.2.3 抑菌物质粗提物制备 PAGEREF _Toc355292584 h 31HYPERLINK l _Toc355292585 4.2.4 基础发酵培养基筛选 PAGEREF _Toc355292585 h 31HYPERLINK l _Toc355292586 4.2.5 菌株D59生长曲线测定 PAGEREF _Toc355292586 h 32HYPERLINK l _Toc35529

31、2587 4.2.6 单因素试验 PAGEREF _Toc355292587 h 32HYPERLINK l _Toc355292588 4.2.7 响应面优化 PAGEREF _Toc355292588 h 33HYPERLINK l _Toc355292589 4.3 结果与分析 PAGEREF _Toc355292589 h 33HYPERLINK l _Toc355292590 4.3.1 菌株D59生长曲线 PAGEREF _Toc355292590 h 33HYPERLINK l _Toc355292591 4.3.2 基础发酵培养基筛选结果 PAGEREF _Toc3552925

32、91 h 33HYPERLINK l _Toc355292592 4.3.3 单因素试验结果 PAGEREF _Toc355292592 h 34HYPERLINK l _Toc355292593 4.3.4 响应面优化 PAGEREF _Toc355292593 h 36HYPERLINK l _Toc355292594 4.4 结论与讨论 PAGEREF _Toc355292594 h 38HYPERLINK l _Toc355292595 第五章 菌株LM2303抑菌作用研究 PAGEREF _Toc355292595 h 40HYPERLINK l _Toc355292596 5.1

33、材料 PAGEREF _Toc355292596 h 40HYPERLINK l _Toc355292597 5.1.1 微生物菌株 PAGEREF _Toc355292597 h 40HYPERLINK l _Toc355292598 5.1.2 试剂 PAGEREF _Toc355292598 h 40HYPERLINK l _Toc355292599 5.1.3 仪器 PAGEREF _Toc355292599 h 41HYPERLINK l _Toc355292600 5.1.4 培养基 PAGEREF _Toc355292600 h 41HYPERLINK l _Toc3552926

34、01 5.2 方法 PAGEREF _Toc355292601 h 42HYPERLINK l _Toc355292602 5.2.1 菌悬液制备 PAGEREF _Toc355292602 h 42HYPERLINK l _Toc355292603 5.2.2 菌株LM2303对有害微生物生长的影响 PAGEREF _Toc355292603 h 42HYPERLINK l _Toc355292604 5.2.3 抑菌物质粗提物制备 PAGEREF _Toc355292604 h 42HYPERLINK l _Toc355292605 5.2.4 抑菌物质抑菌谱测定 PAGEREF _Toc

35、355292605 h 43HYPERLINK l _Toc355292606 5.2.5 真菌孢子悬液制备 PAGEREF _Toc355292606 h 43HYPERLINK l _Toc355292607 5.2.6 抑菌物质对真菌孢子萌发的影响 PAGEREF _Toc355292607 h 43HYPERLINK l _Toc355292608 5.2.7 抑菌物质对真菌菌丝形态的影响 PAGEREF _Toc355292608 h 43HYPERLINK l _Toc355292609 5.2.8 抑菌物质稳定性研究 PAGEREF _Toc355292609 h 44HYPER

36、LINK l _Toc355292610 5.2.9 抑菌物质分离纯化及定性研究 PAGEREF _Toc355292610 h 44HYPERLINK l _Toc355292611 5.3 结果与分析 PAGEREF _Toc355292611 h 46HYPERLINK l _Toc355292612 5.3.1 菌株LM2303对有害微生物的抑制作用 PAGEREF _Toc355292612 h 46HYPERLINK l _Toc355292613 5.3.2 菌株LM2303抑菌物质抑菌谱 PAGEREF _Toc355292613 h 47HYPERLINK l _Toc355

37、292614 5.3.3 对真菌菌丝形态的影响 PAGEREF _Toc355292614 h 48HYPERLINK l _Toc355292615 5.3.4 对真菌孢子萌发的抑制作用 PAGEREF _Toc355292615 h 49HYPERLINK l _Toc355292616 5.3.5 抑菌物质的稳定性研究结果 PAGEREF _Toc355292616 h 50HYPERLINK l _Toc355292617 5.3.6 抑菌物质分离纯化及鉴定 PAGEREF _Toc355292617 h 51HYPERLINK l _Toc355292618 5.4 结论与讨论 PA

38、GEREF _Toc355292618 h 54HYPERLINK l _Toc355292619 第六章 生防菌株在冬枣贮藏中的应用 PAGEREF _Toc355292619 h 55HYPERLINK l _Toc355292620 6.1 材料 PAGEREF _Toc355292620 h 55HYPERLINK l _Toc355292621 6.1.1 菌株 PAGEREF _Toc355292621 h 55HYPERLINK l _Toc355292622 6.1.2 培养基 PAGEREF _Toc355292622 h 55HYPERLINK l _Toc35529262

39、3 6.1.3 试剂 PAGEREF _Toc355292623 h 56HYPERLINK l _Toc355292624 6.1.4 仪器 PAGEREF _Toc355292624 h 56HYPERLINK l _Toc355292625 6.2 方法 PAGEREF _Toc355292625 h 56HYPERLINK l _Toc355292626 6.2.1 冬枣贮藏期致腐真菌的分离 PAGEREF _Toc355292626 h 56HYPERLINK l _Toc355292627 6.2.2 回接验证试验 PAGEREF _Toc355292627 h 57HYPERLI

40、NK l _Toc355292628 6.2.3 冬枣致腐真菌的种属鉴定 PAGEREF _Toc355292628 h 57HYPERLINK l _Toc355292629 6.2.4 冬枣致腐真菌拮抗菌株的筛选 PAGEREF _Toc355292629 h 57HYPERLINK l _Toc355292630 6.3 结果与分析 PAGEREF _Toc355292630 h 57HYPERLINK l _Toc355292631 6.3.1 冬枣致腐真菌的分离鉴定 PAGEREF _Toc355292631 h 57HYPERLINK l _Toc355292632 6.3.2 冬

41、枣致腐真菌拮抗菌株的筛选结果 PAGEREF _Toc355292632 h 59HYPERLINK l _Toc355292633 6.4 结论与讨论 PAGEREF _Toc355292633 h 60HYPERLINK l _Toc355292634 第七章 结 论 PAGEREF _Toc355292634 h 61HYPERLINK l _Toc355292635 参考文献 PAGEREF _Toc355292635 h 62HYPERLINK l _Toc355292636 致 谢 PAGEREF _Toc355292636 h 69HYPERLINK l _Toc35529263

42、7 作者简介 PAGEREF _Toc355292637 h 70广谱高效微生物防腐剂产生菌的筛选及应用 PAGE 92广谱高效微生物防腐剂产生菌的筛选及应用PAGE 93河南工业大学硕士学位论文第一章 前言1.1 研究背景在食品工业中，粮食、果蔬及加工类食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题，据FDA统计，全世界每年约有 10% 20% 的食物损失于各种腐败，其中微生物侵染是导致食物腐败变质的主要因素。各类食物的腐败变质不仅会导致其丧失营养和食用价值，造成巨大的经济损失，而且由于许多微生物在生长繁殖过程中产生的有毒次级代谢产物，还会引起食品安全问题，严重危害人类健康(石立三等, 2008

43、)。据WHO统计，全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中， 70%是由病原微生物污染的食物引起的。因此，防止微生物侵染是食品工业面临重大问题，也是保证食品安全的首要任务。目前，用于各类食品防腐保鲜的方法主要有物理和化学的方法。(1)物理方法：主要是采用热处理、气调、辐照及低温贮藏等方法来防止食品腐败变质，其中热处理和紫外线辐照处理的方法在葡萄、梨、苹果、西红柿等多种果蔬的防腐保鲜应用中取得较好效果(赵明慧等, 2011)。但低温贮藏、辐照处理等物理方法均需要特定的专业设备，难以大面积的普及推广应用(吕劳富和何勇, 2003)。(2)化学方法：主要是运用化学合成药剂来控制病原微生物的侵染，化学方法

44、具有效价高、效果稳定、作用机理明确等显著优点，但长期的研究表明，化学合成药剂对人体不同程度存在一定的毒性，其中一些具有诱癌性和致畸性，在超标使用的情况下甚至会引起食物中毒，而且化学合成药剂长期大量使用会导致病原微生物产生抗性和造成环境污染(刘钟栋, 2005)。由于物理和化学方法在实际生产应用中存在一定局限性，迫切需要寻求更安全有效的防腐保鲜新技术。近年来越来越多的人把目光投向天然防腐剂的开发利用，天然来源的防腐剂分为动植物源和微生物源防腐剂，相对于动植物来源的防腐剂，微生物因为具有生长繁殖快、生长条件简单、易于培养等特点而成为天然防腐剂的重要来源。利用微生物菌株及其代谢产物进行生物防治的研究

45、开发已引起国内外学者的广泛关注，它主要是利用微生物及其代谢产物来抑制病原微生物的生长繁殖从而达到防腐保鲜的目的，生物防治方法是现阶段各类食品防腐保鲜研究的热点 (HYPERLINK javascript:LinkSearch(AUTHOR,贾士儒) 贾士儒, 2009)。目前，世界上公认的、采用微生物发酵法生产并已经投入使用的安全生物防腐剂有：乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素(Natamycin)和-聚赖氨酸(-polylysine)。1.2生防微生物概况1.2.1 用于生物防治的微生物种类利用微生物进行各类食品的防腐保鲜就是选取不会对食品造成危害的微生物来抑制病原微生物的生长繁殖，从而达

46、到防止食品腐败变质或降低食品腐败变质程度的目的，目前研究较多的生防微生物主要有芽孢杆菌(Sharma et al, 2009)、乳酸菌(Jiang et al, 2012)、放线菌(Subramaniam et al, 2011)、酵母菌(Droby et al, 2002)及霉菌(Ippolito A et al, 2000)等，如表1-1所示。表1-1 用于生物防治的微生物微生物种类微生物菌株芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽

47、孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)乳酸菌双歧杆菌(Bifidobacterium)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、乳酸链球菌(Lactic streptococci)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)放线菌白色链霉菌(Streptomyces albus)、球孢链霉菌(Streptomyces

48、 globisporus)、褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida guilliermondii)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、梅奇酵母(Metschnikowia)霉菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿色木霉(Trichoderma v

49、iride)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)其他荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)1.2.2生防微生物的作用机制明确生防微生物的作用机制对该生防菌株的成功应用及技术的推广至关重要。生防微生物的作用机制非常复杂，某一生防菌株的作用机制是单一的还是几种机制协同作用也比较难以断定，而且有些作用机制可能还尚未被发现。随着国内外学者对生物防治研究的不断深入，我们对生防菌株作用机制的认识也在逐步加深。现有的研究结果表明，生防微生物菌株对有害微生物的作用方式主要有拮抗作用、寄生作用、竞争作用和诱导抗

50、性等。(1)拮抗作用拮抗作用指生防菌株通过分泌胞外活性物质的方式来抑制有害微生物的生长繁殖甚至杀死有害微生物的现象，它是生防菌株发挥作用的一个重要机制。生防菌株分泌的胞外活性物质通常在极低的浓度下就能对有害微生物的生长代谢活动产生抑制作用，如荧光假单胞菌产生的吩嗪类抗生素(朱栋华, 2003)、枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素(陈华等, 2008)、明串珠菌产生的细菌素(李曼等, 2008)、木霉产生的木霉素(申屠旭萍等, 2009)等。纪兆林等研究发现地衣芽孢杆菌产生的抗菌蛋白对苹果轮纹病菌、炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发具有显著的抑制作用，可以有效防治苹果贮藏期的轮纹病病害(纪兆林等, 200

51、8)。范青等的研究表明枯草芽孢杆菌B-912对柑橘采后青霉病和绿霉病具有较好的抑制效果，菌株B-912的抑菌机理主要是产生抗菌素(范青等, 2000)。(2)寄生作用寄生作用指生防菌株通过吸附生长、侵入等方式抑制有害微生物生长的现象。寄生作用是拮抗真菌菌株发挥生防作用的重要机制之一，如哈茨木霉(Benhamou and chet, 1993)的菌丝定向生长扩展伸向有害真菌，当接触到病原真菌后，它的菌丝吸附于于病原真菌菌丝体周围，通过分泌蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶等可以降解有害真菌细胞壁的酶类来破坏其细胞骨架，致使其消解死亡，从而表现出抗真菌活性。 (3)竞争作用竞争作用是生防微生物发挥作用的重

52、要机制之一，微生物间的竞争作用主要包括营养竞争和空间位点竞争，指生防菌株通过争夺同一生态环境内的营养和空间位点的方式来抑制病原微生物的生长繁殖。王亮等的研究表明梅奇酵母XY201在冬枣表皮具有很强的定殖能力，在人工气调条件下贮藏，梅奇酵母XY201 能有效抑制冬枣黑斑病的发生，使发病率降低52.5%-59.2%(王亮等, 2010)。Charles等发现玉米内生芽孢杆菌能在玉米体内迅速生长繁殖，占领生态位点，从而达到抑制病原真菌生长的效果(Charles et al, 2001)。(4)诱导抗性 近年来，拮抗菌株诱导采后果蔬产生抗性成为了果蔬采后贮藏期病害生物防治的研究热点(李淼, 2010)

53、。已有的大量研究表明，有些生防菌株或其代谢产物能引起果蔬发生一些生理生化反应，提高果蔬自身某些酶的活性，从而使果蔬产生对多种病原微生物的抗性，这种现象称为诱导系统抗性。研究发现，出芽短梗霉(Ippolito A et al, 2000)、毕赤酵母(Fan et al, 2000)、假丝酵母(Ghaouth et al, 2003 )、枯草芽孢杆菌(Ongena, 2007)等均能诱导多种果蔬发生生理生化反应，提高果蔬自身的抗性，减少其在采后贮藏期的腐烂。1.3生防芽孢杆菌芽孢杆菌(Bacillus)是一类嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，具有抗逆性强，易于分离培养，生理特征丰富多样，能够

54、代谢产生多种具有抑菌活性的胞外物质，抑菌谱广等显著优点，且该菌在自然界中广泛存在，对环境无污染，对人畜无毒无害，是理想的生防微生物菌株。近年来，国内外学者对芽孢杆菌在生物防治中的应用开展了大量研究，用于生物防治的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus

55、 coagulans)等。范青等分离筛选得到的枯草芽孢杆菌B-912对柑桔青霉病、绿霉病均具有较好的防治效果(范青等, 2000)。杨震等的研究结果表明采用1108 CFU/mL的枯草芽孢杆菌BS-331菌悬液浸泡油桃可达到与纳他霉素(300 mg/L)相当的防治油桃采后病害的效果(杨震等, 2008)。纪兆林等研究发现地衣芽孢杆菌产生的抗菌蛋白对苹果轮纹病菌、炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发具有显著的抑制作用，可以有效防治苹果贮藏期的轮纹病病害(纪兆林等, 2008)。陈莉等从棉花根际土壤中分离得到短短芽孢杆菌A57，平板对峙培养试验中菌株A57对棉花立枯病菌、枯萎病菌和黄萎病菌的平均抑制率分别

56、达到33.15%、39.15%、29.15%，具有良好的生防应用潜力(陈莉等, 2007)。王奕文等从甜瓜果皮分离得到一株解淀粉芽孢杆菌EXWB3-03，对峙培养试验结果表明菌株EXWB3-03对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、链格孢(Alternaria alternata)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黑曲霉(Aspegillus niger)和粉红单端孢霉(Trichothecium roseum)等8种果蔬采后病原真菌均具有显著的拮抗作用(王奕文等, 2008)。赵德立等研究发现多粘芽孢杆菌JW2725对柑橘青霉菌具有很强的拮抗作用(赵德立等, 2

57、006)。1.4芽孢杆菌抑菌物质研究概况1952年，Babard等首次从枯草芽孢杆菌发酵液中分离出抗真菌肽，至今国内外学者已从枯草芽孢杆菌的不同菌株中发现60多种具有抑菌活性的物质。研究发现枯草芽孢杆菌可以通过核糖体合成途径和非核糖体合成途径产生抑菌物质，核糖体合成途径产生的抑菌物质主要有细菌素类(罗秀针等, 2008)、细胞壁降解酶类(顾真荣等, 2004)、活性蛋白类(谢栋等, 1998)等。非核糖体合成途径产生的抑菌物质主要有脂肽类(高学文和姚仕义, 2003)、多肽类(孙晓宇等, 2010)、酚类(张慧等, 2011)、挥发性物质(Hua Chen et al, 2008)等。其中脂肽

58、类抑菌物质由于具有理化性质稳定、抑菌活性高、抑菌谱广等优点而成为研究开发的热点。根据脂肽类物质在结构上的差异，可以将其分为Surfactins，Iturins和Fengycins三大类。Surfactins是一类基本结构相似的生物表面活性剂的总称，主要包括枯草芽孢杆菌产生的Surfactin、地衣芽孢杆菌产生的Lichenysin、短小芽孢杆菌产生的Pumilacidin和Esperin(Meiji and Michel, 1969; Yakimov et al, 1995; Naruse et al, 1990)，如图1-1所示。枯草芽孢杆菌产生的Surfactin是由-羟基脂肪酸和含有7个

59、氨基酸的肽链以内酯键结合而成的环状脂肽，其分子中的肽键呈马鞍型立体构象，脂肪酸碳链长度一般为13-15个。枯草芽孢杆菌Surfactin由于肽链中氨基酸的种类、脂肪酸碳链长度及支链位置的不同而形成多个结构类似物，肽链中2、4、7位的氨基酸易被其它氨基酸所取代。枯草芽孢杆菌Surfactin是迄今发现效果较好的生物表面活性剂之一，具有很强的乳化性能，具有抗病毒、抗真菌及抗细菌活性，在医药、食品、化妆品、环境治理、微生物采油等领域具有很好的应用发展前景(杨福廷, 2006; 吕应年等, 2004; 邓建良等, 2010)。图1-1 Surfactins基本结构Iturins是一类对真菌具有较强拮抗

60、作用的脂肽抗生素(Ohno et al, 1993)，主要包括Iturin A、C，Bacillomycin L、D、F、LC和Mycosubtilin等(Yao et al, 2003)，如图1-2所示。Iturins由-胺基脂肪酸和含有7个氨基酸的肽链以酰胺键结合成环状，脂肪酸链一般由14-17个碳组成，具有高效广谱的抗真菌活性和一定的抗细菌活性。图1-2 Iturins 基本结构Fengycins是另一类具有抗真菌活性的脂肽，主要包括Fengycin A 、B，Plipastatin A 、B，如图1-3所示(Schneider, 1999)。Fengycins对丝状真菌具有较强的抑制作