包头医学院微生物学与微生物检验实验指导

1、微生物学与微生物检验实验指导医学技术系微生物与免疫检验教研室微生物学与微生物检验实验的目的要求1通过实验来验证理论，使课堂效果更为生动，学到的知识更为巩固。2通过学生亲自动手操作，得到比较全面的微生物学基本操作技术的训练。3在微生物学实验课的过程中，帮助学生建立无菌观念，掌握无菌操作技术。4帮助学生熟悉和掌握常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法以及各种临床标本的微生物学检查的基本程序。5在实验过程中培养学生独立操作、独立思考、分析问题和解决问题的能力。微生物学实验室规则及注意事项一、微生物学实验室规则在进行微生物学实验时，须时刻牢记实验的对象是病原微生物，任何疏忽都可能导致严重的后

2、果，不仅自身有可能被感染，而且有可能将病原微生物传给他人。因此决不能有丝毫侥幸心理，冒任何不必要的危险。迸入实验室时必须遵守下列规则。1进实验室时必须穿自大衣，离室时脱下反折，白大衣要经常清洗消毒。2每次实验后均要用肥皂洗手，必要时用消毒药水泡手。3书包、衣物等勿带入实验室，必要的文具、实验指导、笔记等带入后，放在指定的地方。4每次实验后均用消毒药水擦洗工作台面，并用紫外线灯照射过夜。5在实验室内不准吃东西、喝饮料和吸烟，不可把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头面等部位。6进入实验室后要保持安静，禁止高声谈话，不准打闹嘻笑。7必须按照老师指定的方法，小心地处理传染性材料、培养物和污染的物质，要

3、正确地使用存放污染器材的各种消毒容器。8接种环使用前后必须进行烧灼灭菌。9必须小心地避免任何有菌材料的溅出，若不慎污染了工作台、手、眼、衣服和地面等处，应立即报告老师，以便及时作适当处理。10培养物和传染性材料须放在工作台的安全部位，尽可能保持台面的清洁整齐。11爱护公物，合理使用实验材料和器材，如不慎损坏了某些器具，应及时报告老师，听候处理。12实验完毕后值日生清理台面，将需培养的标本及时放入培养箱，并打扫地面，关闭水、电、煤气和门窗，带课教师检查合格后方可离开实验室。二、实验室意外的紧急处理办法1皮肤破损 先除去异物，用蒸馏水或生理盐水洗净后，涂2%红汞或2%碘酒。2烧伤 局部涂凡士林、5

4、%鞣酸或2%苦味酸。3化学药品腐蚀伤 若为强酸，先用大量清水冲洗，再以5%碳酸氢钠溶液洗涤中和；强碱腐蚀伤时先以大量清水冲洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗涤中和。若受伤处是眼部，经过上述步骤处理后，再滴入橄榄油或液体石蜡1一2滴。4菌液误人口中 应立即吐入消毒容器内，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口；并根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。 5菌液流洒桌面 将适量2%一3%来苏尔或0.1%新洁儿灭倒于污染面，浸泡半小时后抹去。若手上有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再用肥皂和水清洗。 6火警 如发生火警疫情时须沉着处理，切勿慌张，应立即关闭电闸和煤气阀门。如酒精、乙醚、汽油等有

5、机溶液起火，切忌用水扑救，可用沙土等扑灭火苗。三、实验时的注意事项(一)严格遵循实验指导1在开始做实验以前，须仔细阅读实验指导，进行独立思考，并根据实际情况，作出实验的具体安排和打算。2.合理安排时间和实验材料，尽量避免出错，力求取得理想的结果。(二)认真完成实验操作1认真听取指导老师实验前的讲解。2细心操作，若发现问题，在独立思考分析原因的基础上找老师帮助。 3在自己的实验材料上作好标记，包括班级、姓名、菌名、日期等。 4认真观察自己的实验结果，将其记录在实验报告中（根据需要用彩色笔绘图记录)，并回答实验报告中所有的问题。5遇到实验结果与理论不符的情况，应仔细分析原因，培养自己独立思考、分析

6、问题和解决问题的能力。 实验1 细菌涂片的制备和革兰染色目的要求1掌握革兰染色的原理、方法；2熟悉细菌涂片的制备。3学会在在显微镜下观察和描述细菌。器材和试剂1菌种 葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌。2试剂 革兰染色液、生理盐水、擦镜液。3、光学显微镜、载玻片步骤和方法 1涂片制备 (1)涂片:取一张洁净载玻片，将大肠杆菌液体培养物直接涂布于载玻片。或先在载玻片上放置一接种环生理盐水，再取固体培养基上少许葡萄球菌或蜡样芽孢杆菌与生理盐水磨匀。涂成lcmlcm大小的区域，取菌量不可太多，使盐水磨成灰白色为宜。 (2)干燥:涂片最好在室温下自然干燥，或将标本片接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，

7、切不可放在火焰上烧干。 (3)固定:干燥后的标本片迅速通过火焰3次。这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉。 2革兰染色 （1）原理: 1)革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质食量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。2)革兰阳性菌等电点(pI23)比革兰例性菌(pI45)低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固;不易脱色。3）革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。

8、(2)方法:1）初染：滴加结晶紫23滴于涂布细菌处，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。2)媒染:滴加卢戈（Lugol）碘液数滴，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。3)脱色:滴加95%乙醇数滴。轻轻晃动玻片;使玻片上流下的乙醇液无紫色为止，大约30秒左右(灵活掌握时间)，用流水冲洗，用于。 4）复染:滴加稀释石炭酸复红液数滴，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。待标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，在涂菌处滴加一滴香柏油。然后用油镜观察；染色结果:葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性菌，呈葡萄状排列的球菌；变形杆菌染成红色，为革兰阴性菌，单个散在分布的杆菌。影响因素：一是操作因素，涂片太厚或太薄，菌体分散不均

9、匀，可影响染色结果。固定时应避免菌体过分受热。二是染液因素;所有染液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脱色用的乙醇以95%浓度为宜，若瓶密封不良或涂片上积水过多，可使乙醇浓度降低而增强脱色能力。三是细菌因素，不同时间的细菌培养物，染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色。而老龄菌染成红色。细菌染色一般用18一24h的细菌培养物。附录革兰染色液配制1结晶紫染液:称取结晶紫48g，溶于100ml95%乙醇中制成饱和液。取20ml饱和液80ml 10g/L草酸铵溶液混合即成，过滤后备用。2.卢戈(Lugol)碘液:先将2g碘化钾溶于I0ml蒸馏水中，再加1g碘，

10、待碘全部溶解后再加300ml蒸馏水即成。3.95%乙醇或丙酮乙醇溶液(70m195%乙醇加3Oml丙酮)。4.稀释石炭酸复红液:称取4g碱性复红溶解于100m195%乙醇内，即成碱性复红饱和酒精溶液，吸取lOml饱和液和90m50g/L石炭酸水溶液混匀即成石炭酸复红液。量取10ml石炭酸复红液加90ml蒸馏水混匀即成。 实验2 培养基制备技术目的要求1. 掌握培养基制备的基本过程。 2熟悉常用培养基的原理、种类及其用途。器材和试剂1.试剂 牛肉膏、氯化钠、蛋白陈、琼脂粉、抗凝绵羊血、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢铵、硝酸钾、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、硫酸亚

11、铁、尿素、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、酚红、lmol/LNaOH、lmol/LHCl。2.器材 5OOml锥形瓶、5OOml量筒、lOml、5ml和1ml吸管、精密pH试纸、华氏试管、硅胶塞、天平、高压蒸气锅、血清凝固器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿。步骤和方法1.培养基制备的基本过程 包括调配成分、溶解、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、质量检查和保存。(1)调配成分:按培养基组成准确称取各成分用量，放人锥形瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，使其充分混合。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。(2)溶解:将调配好的混合物在沸水浴或流动蒸气灭菌器中，使其完全溶解。不可将培养基装在铜铁

12、容器中加热，因培养基中含铜量超过0.3mg/L时，细菌不易生长；含铁量超过0.14mg/L时可抑制细菌毒素的产生。(3)矫正pH:一般将培养基的pH凋至7.27.6左右。经高压灭菌后其pH可发生0.10.2变动。若用NaOH矫正，高压灭菌后pH下降0.l0.2；若用NaCO3矫正，高压灭菌后pH升高0.1一0.2。(4)滤过澄清:自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。(5)分装:1）基础培养基:一般分装于锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；2）琼脂斜面:通常在熔化后分装于

13、试管，量约为试管高度的1/41/3，加塞后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3，且保持试管下端有lcm柱高；3）半固体培养基:分装量为试管容量的1/41/3，加塞灭菌后趁热直立凝固；4）琼脂高层培养基:分装量为管长的2/3(接种厌氧菌用)，灭菌后趁热直立凝固；5）琼脂平板无菌分注:先将灭菌琼脂熔化后冷却至5O0C左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内(内径90mm的平皿约1315ml)，水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置40C保存备用。(6)灭菌:1)由耐热物质配制成的培养基(如普通营养琼脂等)常用高压蒸气灭菌，条件为103.43kPa，l52Omin；含糖培养基以68.95kPa

14、，l0l5min为宜，以免破坏糖类物质。2)不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用流通蒸气灭菌，方法是加温80100C3Omin，每天一次，连续3天。3)富含蛋白质的培养基(如含血清或鸡蛋清的培养基需用血清凝固器灭菌，方法是将配制好的培养基摆放在血清凝固器内(一般做成斜面)，第一天750C3Omin，第二天800C3Omin，第三天850C3Omin。在三次灭菌的间隙将培养基取出置350C孵箱中过夜。(7)质量检验:需做无菌试验和效果试验。1）无菌试验:将灭菌后的培养基置350C孵育24h，无任何细菌生长为合格；2）效果试验:将已知的标准参考菌株接种于待检培养基中。检查细菌的生

15、长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。(8)保存:制备好的培养基应注明名称、制作日期，如琼脂平板应将底(带培养基的平面)朝上，盖在下;用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内，以减少水分蒸发。液体培养基应直立放置。制作好的培养基应存放于冷暗处或40C冰箱。2.常用培养基的制备(1)肉汤:将新鲜牛肉(去除筋和脂肪)5009绞碎加水。40C过夜。加热45500Clh，用数层纱布或滤纸过滤，加水补充至1OOOml。再加入蛋白胨lOg和NaCl5g加热熔化，冷至40500C。矫王pH至7.4一7.6。分装于锥形瓶或试管内，加塞后高压蒸气灭菌；103.43kPa 2Omin。冷后放阴暗处或40C备用。供作无糖基

16、础培养基用。适用于营养要求一般的细菌。(2)肉膏汤:将牛肉膏3g、蛋白陈lOg。NaCl5g、蒸馏水l0OOml置锥形瓶或大容量烧杯中，加热熔化后矫证pH至7.6，煮沸35min，过滤后分装，高压灭菌103.43kPa2Omin后。40C贮存。供作无糖培养基用，适庙营养要求一般的细菌。(3)普通琼脂(营养琼脂):将肉汤或肉膏汤1000ml、琼脂20g混合，加热熔化，调pH 至7.6，趁热分装试管或锥形瓶，加塞后高压灭菌103.43kPa 2Omin,取出试管摆成斜面，待琼脂凝固后即成琼脂斜面；锥形瓶中的琼脂冷至5O0C左右倾注灭菌平皿，凝固后即成普通琼脂平板。供一般细菌培养用，可作无糖基础培养

17、基。（4）半固体培养基:将肉汤或肉汤膏1000ml(已调pH至7.6，下同)，琼脂5g混合,加热熔化后凋pH至7.6，分装小试管，每管2ml，加塞，高压灭菌103.43kPa 2Omin，取出后直立待凝即成。可作观察细菌动力和保存菌种用。(5)血液和巧克力琼脂培养基:将灭菌后的普通琼脂培养基(pH7.6)加热熔化，冷至5O0C左右。以无菌操作加入无菌脱纤维羊血(临用前置370C水浴预温30min)。轻轻摇匀(避免产生气泡)，分装于无菌试管和平皿内，凝固后即成血液琼脂斜面和血液琼脂平板。 若在琼脂温度800C时加入血液。并在800C水浴中摇匀3Omin，倾注平板后即成为巧克力琼脂平板。血液琼脂用

18、于分离培养和保存营养要求高的细菌；巧克力琼脂主要用于分离培养奈瑟菌属、嗜血杆菌属、肺炎链球菌等苛养菌。注意事项1培养基的澄清 如需要制备十分澄清的培养基，可用卵蛋白加热澄清法。其方法为:取一个蛋的卵蛋白加水2Oml，搅拌至出现泡沫，倒入l0OOml液体或熔化的固体培养基中混匀。然后在流动蒸气中加热306Omin，使培养基中不溶性物质附着于凝固蛋白，取出后以纱布夹脱脂棉(固体培养基)或滤纸(液体或半固体培养基)过滤即可。 2平板的浇注 倾注培养基时，切勿将皿盖全部开启，以免空气中尘埃及细菌等微生物的落入。 倾注时若培养基温度过高，冷凝水过多，易致污染。不易分离到菌落；若温度过低，部分琼脂凝固，倾

19、注平板表面高低不平。可在无菌室或接种罩内倾注培养基后。将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝。这样便于蒸气散发，减少平板内冷凝水。倾注血液琼脂时，由于加血时琼脂表面容易产生气泡，倾注时应适时转动锥形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面的气泡。实验3 空气中细菌的检测与消毒剂消毒效果评价目的要求1.掌握沉降平板法的原理。2.掌握消毒效果的评价方法，了解常用消毒剂的使用范围和适用浓度。器材和试剂1培养基及试剂 普通营养琼脂培养基、50液态灭菌普通营养琼脂培养基、1：500的84消毒液、无菌生理盐水2其他 灭菌100ML三角烧瓶（含玻璃珠）、灭菌平皿、无菌1ml、10ml吸管、灭菌试管、消毒棉签、灭菌

20、55空心规格板、火柴、蜡笔、试管架、喷雾器、酒精灯、恒温水浴箱。步骤和方法一、空气中细菌的检测1.沉降平板法的原理：利用微生物气溶胶粒子受重力作用沉降到敞开的营养琼脂平板上，对空气中细菌进行采样计数。2.方法：1）于室内四角及中央各放营养琼脂平板（或血琼脂平板）一个，于同一时间揭开皿盖，暴露20分钟。置370C孵育24h。2）计数5各平板菌落总数并算出每立方米空气中所含细菌数。参考表1作出评价。 50000N每立方米空气中的细菌数= AtA:所用平皿面积（cm2）。T：暴露于空气的时间（分钟）。N：培养后，平皿上菌落数。表1 居室内空气卫生细菌学评价参考标准 夏季标准（个/m3） 冬季标准（个

21、/m3）空气评价 细菌总数 绿色和溶血性链球菌 细菌总数 绿色和溶血性链球菌清洁空气 1500 16 4500 24污染空气 1500 36 7000 36 二、物体表面消毒及效果评价：1.消毒前的采样：选择可能被污染的对象（如桌面、墙面）放上灭菌55空心规格板，取一支无菌棉签用生理盐水浸湿，在规格板的空心处，有顺序的涂擦，然后将棉签放入盛有25ml生理盐水的三角烧瓶中，制成原液，充分混匀，备用。 2.消毒后的采样：选择与消毒前污染程度差不多的部位，用装有84消毒液的喷雾器喷雾消毒，待干（20分钟左右），用上述同样方法采样，并制成原液备用。3.将消毒前后的样品用无菌生理盐水做1：10、1：10

22、0、1：1000、1：10000的倍比稀释4用无菌操作的方法取不同稀释度液体1ml注于直径90mm的无菌平皿，每个稀释度做两个平行样，做一个空白对照，然后加入已融化并冷却至50的营养琼脂15ml ,立即在平面上向同一方向平稳转动，使之混匀，待凝固后翻转平板。1ml标本中活菌数=全平板cfu稀释倍数5.菌落计数方法：1）平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。记下各平板上的菌落数后，应求出同一稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。2）在求同一稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。3）若片状菌落不足平

23、板一半，而其余中菌落数分布均匀，则计数后乘2代表全平板菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。6.不同稀释度平均菌落数的确认：1）应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表例1）。2）若有两个稀释度其生长之菌落数均在30-300，则应视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告平均数。 若其比值大于2则报告其中较小的数字（见表例2和3）。3）若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例4）。4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例5）。5） 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-

24、300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之 （见表例6）。6）若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数报告之（例7）。表2 稀释度选择及细菌总数报告方法例子 稀释液及菌落数 相邻稀释度菌落数在 菌落总数 报告方式 10-1 10-2 10-3 30-300间的比值 （cfu/ml） （cfu/ml）1 1,365 164 20 16，400 16，000或1.6*1042 2,760 295 46 1.6 37，750 38，000或3.8*1043 2,890 271 60 2.2 27，100 27，000或2.7*

25、1044 不可计 4，650 513 513，000 510，000或5.1*1055 27 11 5 270 270或2.7*1026 不可计 305 12 30，500 31，000或3.1*1047 不可计 不可计 不可计 10-3无法计数7)所有稀释度均未见菌落：则报告小于10，而不报告0.6.菌落数报告方式： = 1 * GB3 菌落数100时按实数报告，未见菌落数者报告为小于10. = 2 * GB3 菌落数100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入法计算，也用10的指数表示。 = 3 * GB3 在报告菌落数为“无法计数”时，应注明待检标本的稀释倍数。具体报

26、告方式见表。根据消毒前后的菌落数，求出消毒前后细菌减少的百分比。 消毒前菌落数-消毒后菌落数消毒前后细菌减少的百分比= 100% 消毒前菌落数根据计算结果，评价该次消毒的效果。一般以90%以上为很好，80%为良好，70%为较好，60%为一般，60%以下为不合格。实验4 肉中沙门氏菌的检测目的要求掌握沙门氏菌的形态、染色特性、培养特性、生化反应及检验程序掌握沙门氏菌的血清学鉴定方法器材和试剂1标本 变质肉2培养基及试剂 缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿増菌液、亚硫酸盐胱氨酸増菌液、伊红美兰琼脂平板、SS琼脂平板、动力吲哚尿素培养基、柠檬酸盐培养基、尿素培养基、克氏双糖铁培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、甲

27、基红试剂、VP试剂、硝酸盐培养基及A、B试剂、沙门菌O及H因子单价血清、3%过氧化氢溶液。3其他 高压灭菌器、恒温培养箱、接种环、接种针、载玻片、革兰染液、生理盐水。步骤和方法标本采集及运送：（1）采样是食品检验中的一个重要环节，所采样品应具有代表性。（2）采样必须用灭菌器具，严格执行无菌操作。（3）样品可分为大、中和小样三类。大样指一整批食品；中样指从样品各部分随机抽的混合样品，以200g为准；小样指做分析用的检样，以25g为准。食品微生物检验一般取小样。根据食品的种类采取不同的 采样方法。如固体粉末和液体混合后取样；袋、罐、瓶装食品应取未开封的完整体；冷冻食品在冷冻状态取样，非冷冻食品需在

28、0-5保存。（5）样品采集后应立即送检，一般不应超过3h。2、检验方法：食品中沙门菌的检验方法有四个基本步骤：即前增菌或选择性增菌；选择性平板分离沙门菌；生化试验鉴定到属；血清学分型鉴定。（1）增菌培养：将标本25g加入装有225ml缓冲蛋白胨水的500ml广口瓶中。固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于361培养4h，移取10ml，转接种在100ml氯化镁孔雀绿増菌液或四硫酸钠煌绿増菌液内，361培养18-24h.鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必进行前增菌。直接取样25g（25ml）加入灭菌生理盐水

29、25ml，按前述方法制成匀液，取25ml接种于100m亚硫酸盐胱氨酸増菌液内，361培养18-24h.（2）分离：取増菌液分别接种到伊红美兰琼脂平板、SS琼脂平板，361培养18-24h.（3）菌落观察：由于本菌不分解乳糖并产碱，所以在SS琼脂和麦康凯平板上形成无色或淡黄色、半透明、圆形、凸起、边缘整齐的光滑湿润小菌落。产H2S的菌株可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。（4）生化反应1）氧化酶试验：取氧化酶纸片，刮取SS琼脂上的较大的菌落，观察纸片颜色的变化，呈蓝紫色为阳性，不变为阴性为阴性（如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，阳性者则为红色）。沙门氏菌氧化酶试验为阴性。2）初步试验鉴定：将沙门氏

30、菌分别接种在克氏双糖铁琼脂、动力吲哚尿素培养基、葡萄糖蛋白胨水管和硝酸盐培养基管中，经35孵育18-24h后，加入相应试剂，观察结果。同时做触酶试验。结果见表1表1 沙门氏菌的基本生化反应KIA MIU 硝酸盐 氧化酶 触酶 还原斜面 底层 产气 H2S 动力 吲哚 脲酶伤寒沙门菌 K A - +/- + - - - + +甲型副伤寒 K A + -/+ + - - - + +乙型副伤寒 K A + + + - - - + +氧化酶试验原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。甲基红试验的原理

31、：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解，产生甲酸等，使pH降至45以下，加入甲基红试剂则呈红色为阳性。若分解葡萄糖产酸量少，则pH 62以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。V-P试验原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧氧化为二乙酰，进而与胍基起作用生成红色化合物，则为V-P试验阳性动力靛基质尿素酶培养基原理：制备的动力靛基质尿素酶培养基除加有200g/L尿素和酚红指示剂外，其蛋白胨较原克利斯顿森尿素培养基提高10倍，并制成半固体培养基，以便观察细菌的动力。由于蛋白胨中含有丰富的色氨酸，产生色氨酸酶的细菌可以水解色氨酸形成靛基质，当加入靛基质试剂后形

32、成玫瑰吲哚。产生玫瑰红色为阳性。产生尿素酶的细菌将培养基中的尿素分解产碱，使酚红指示剂显桃红色。因此，该试验可同时观察细菌动力、靛基质的产生和细菌分解尿素的活性，故简称为MIU试验过氧化氢酶试验原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸

33、盐还原为亚硝酸盐有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮。（5）沙门氏菌的血清学分型鉴定：待检菌形态、培养、生化反应疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。首先用A-F群多价诊断血清作玻片凝集试验，在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在5min内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验（伤寒和丙型副伤寒沙门菌具有Vi抗原），若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，100水浴15min（破坏Vi抗原），再与A-F群多价“O”诊断血清做凝集试验。若与A-F群多价“O”血清发生凝集，应再与沙门菌”O”单价

34、因子血清分别作玻片凝集试验，以确定该菌株属于的群别。一般先选用本地区检出率最高血清型的相应血清作玻片凝集反应。若已确定是何种血清型沙门菌，再分别用H因子血清先检查第一相抗原，然后检查第二相抗原，最后确定该菌种属于哪一型沙门菌。结果报告：综合上述生化和血清学试验的结果，对食品中沙门菌做出菌型判断，并报告结果。注意事项：1、严格遵守无菌操作规范。2、采样注意代表性、采样后立即送检。3、挑选典型菌落进行生化反应。4、血清学试验中取菌量要适宜，保证抗原-抗体的最佳比例。附录1糖发酵培养基肉汤膏（pH7.47.6） 100ml糖 0.51g16g/L溴甲酚紫乙醇溶液 0.1m1将上述成分溶解后，分装试管

35、。经55.16kPa高压灭菌l5min。如需观察产气，可于每试管中加小倒管一支；如加入的糖为双糖必须灭菌后加入培养基内。2尿素培养基蛋白陈 1g氯化钠 5g葡萄糖 1g尿素 20g磷酸二氢钾 2g2g/L酚红液 6m1蒸馏水 1000m1以上各成分(除尿素外)加热溶解，调整pH至6.8，以68.95kPa灭菌l5min后，以无菌操作加入已过滤除菌的尿素溶液，混匀后分装试管，置40C冰箱保存备用。3克氏双糖铁复合培养基蛋白胨 20g牛肉膏 3g酵母膏 3g乳糖 10g 葡萄糖 1g 氯化钠 5g柠檬酸铁铰 0.5g 硫代硫酸钠 0.5g 琼脂 1215g 49/酚红水溶液 6m1 蒸馏水 100

36、0m1 除糖类和酚红外，其他各成分均加热溶解，矫正pH至7.47.6，再加入糖类和酚红水溶液，混匀，过滤分装，每管3m1，68.95kPa灭菌l5min，取出后制成斜面。实验5 金黄色葡萄球菌的检测目的要求掌握金黄色葡萄球菌检测的基本程序熟悉金黄色葡萄球菌检测的基本方法与步骤。器材和试剂1样品 可疑奶粉 2培养基及试剂 普通营养琼脂平板、血琼脂平板、却普曼琼脂平板、7.5%NaCl肉汤培养基、甘露醇发酵管（微）、甲苯胺蓝DNA琼脂平板、葡萄糖微量发酵管、新鲜抗凝血浆（人或兔）。3其他 接种环、接种针、载玻片、革兰染液、香柏油、擦镜液、生理盐水。步骤和方法一、检验程序1：10奶粉稀释液 7.5%

37、NaCl肉汤增菌 直接计数 血平板和却普曼琼脂平板 观察菌落特征，革兰染色镜检 血浆凝固酶试验、甘露醇试验 耐热核酸酶试验、肠毒素测定等二、检验方法1、样品的采取和送检（1）散装或大型包装的乳品检样：用灭菌刀、勺取样。在移采另一件样品前，应将用过的刀、勺清洗灭菌。采样时应注意不同的部位、使样品有代表性。样品仿品放入灭菌器内，及时送检。(2)小型包装的乳品检样：应采取整件包装，奶粉1瓶或1包。采样时应注意包装的完整性。（3）成批产品质量的检样：采样量一般以1的比率抽取，应注意代表性，不足千件者抽取1件。2、检样处理（1）罐（瓶）装乳粉：将罐或瓶表面先用温水洗净，再用点燃的酒精棉球消毒瓶或罐的上表

38、面，然后用灭菌的开罐器打开罐或瓶面，以无菌手续称取25g检样，放入装有玻璃珠的三角烧瓶内，然后徐徐加入225ml温热的灭菌生理盐水，（先加少许使乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结块）。振摇均匀，使充分溶解后即为1：10稀释液。（2）袋装乳粉：可用75%的酒精棉球擦拭消毒袋口后，以无菌手续开封取样。以后操作同罐（瓶）装乳粉。增菌培养：用无菌吸管吸取上述稀释液5ml加入7.5%NaCl肉汤或胰酪胨大豆肉汤45ml培养基内，置37温箱培养24h。再肉汤中呈浑浊生长，胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。分离培养：直接取可疑奶粉或增菌培养物划线接种至血平板或却普曼琼脂平板，经37孵育18

39、-24h后观察菌落。取可疑菌落做革兰染色镜检。根据形态染色特性，然后进一步做生化反应鉴定。生化反应（1）触酶试验：本试验用于初步区别葡萄球菌和链球菌，前者为阳性，后者为阴性。（2）血浆凝固酶试验：1）原理：致病性葡萄球菌产生的一种能凝固人和兔血浆的蛋白质。可分为两种： 结合型血浆凝固酶直接作用于血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集，可用玻片法测出。 另一种是分泌至菌体外的游离型凝固酶，作用类似凝血酶原，可被人或兔血浆中协同因子激活变成凝固酶样物质，使液态的纤维蛋白原变成固态的纤维蛋白，进而使血浆凝固，可用试管法测出。2）方法：玻片法：取人或兔血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的

40、破片上，挑取可疑菌落分别与血浆和盐水混合；试管法：取试管2支，各加0.5ml人或兔血浆和生理盐水，挑取被检菌分别加入血浆中并混匀，于370C水浴3-4小时3）结果判断、解释和报告：玻片法以血浆中有明显颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性，反之，细菌在血浆中呈均匀混浊则为阴性；试管法以血浆凝固判为阳性，反之，试管内血浆不凝固仍流动的，则为阴性。若阴性，应继续观察到24h，仍不凝固者为阴性。4）临床意义：血浆凝固酶试验被广泛用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其它葡萄球菌，常作为鉴定葡萄球菌致病性的主要依据之一，金黄色葡萄球菌的本试验为阳性，表皮和腐生葡萄球菌为阴性。（3）耐热核酸酶测定：1）原理：致病性葡

41、萄球菌能产生一种耐热核酸酶，能将DNA水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。水解后的DNA短链与甲苯胺蓝结合，使甲苯胺蓝DNA琼脂显示粉红色。非致病性葡萄球菌虽然也能产生DNA酶，但不耐热。因此耐热DNA酶测定可作为鉴定致病性葡萄球菌的重要指标。2）方法：玻片法：取融化好的甲苯胺蓝DNA琼脂3ml均匀浇在载玻片上，待琼脂凝固后打上68个孔径25mm的小孔，各孔分别加1滴经沸水浴3min处理过的待检菌和阳性、阴性对照葡萄球菌培养物，37孵育3h，观察有无粉红色圈及其大小。平板法：在已形成葡萄球菌菌落的 平板上挑选待检菌并做好标记，置60烤箱加热2h（使不耐热的DNA酶灭活），取出后平板上倾注10

42、ml已预先融化的甲苯胺蓝DNA琼脂，37孵育3h，观察菌落周围有无粉红色圈。划线刺中法：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种划线刺中于甲苯胺蓝DNA琼脂平板上，371培养24小时，观察刺中线周围有无淡粉红色出现。3）结果判断、解释和报告：玻片法孔外出现粉红色圈的为阳性；平板法葡萄球菌菌落周围有无粉红色圈的为阳性。金黄色葡萄球菌的本试验为阳性，表皮和腐生葡萄球菌为阴性。（4）甘露醇发酵试验：1）原理：致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培养基由紫色变为黄色。2)方法：将待检菌分别接种于两支甘露醇发酵管，其中一支滴加灭菌的液体石蜡（不低于1cm ）, 35培养1824小时后观察结果。3

43、）结果判断、解释和报告：两支培养基均混浊，由紫色变为黄色为甘露醇发酵试验阳性，两支都为紫色或只有一支变为黄色为阴性。金黄色葡萄球菌的本试验为阳性，表皮和腐生葡萄球菌为阴性。（5）肠毒素测定：1）琼脂扩散试验：金黄色葡萄球菌肠毒素与肠毒素抗血清在琼脂板上可形成白色沉淀线。2）ELISA法：利用双抗体夹心法，测定标本中金黄色葡萄球菌产生的肠毒素。3)动物试验：金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是一种耐热性蛋白质，通常在10030min不被破坏，注入动物后可产生食物中毒的症状。结果报告：综合上述试验的结果，对食品是否污染金黄色葡萄球菌做出判断，并报告结果。实验6 蜡样芽孢杆菌的检测目的要求掌握蜡样芽孢杆菌检

44、测的主要步骤和方法。掌握蜡样芽孢杆菌菌落的观察方法和生化反应结果的判断。器材和试剂1样本：变质剩米饭2培养基及试剂 普通营养琼脂平板、血琼脂平板、卵黄琼脂平板、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘露醇微量发酵管、蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，枸橼酸盐培养基，明胶培养基。吲哚试剂、VP试剂、鞭毛染色液、3%过氧化氢3其他 接种环、接种针、载玻片、革兰染液、香柏油、擦镜液、生理盐水。步骤和方法1.样品的保存与送检：待检样品应保持在6以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后，应保存于4并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验，应将样品储存在-20，检验前再于室温下解冻，脱水食品可在室温下送检和储存。2.样

45、品的制备（1）用无菌操作的方法称取可疑食品50g放于无菌均质杯中。（2）加450ml无菌磷酸盐缓冲液于均质杯中以18000-20000r/min离心，2min，制成1：10样品稀释液。（3）取1：10稀释液10ml加到含有90ml无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1：100的稀释液。（4）每个稀释度换用1支10ml灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10-6.3活菌计数取各稀释度的悬液0.1ml接种于卵黄琼脂平板上。以灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面，每个稀释度接种2个卵黄琼脂平板。置35培养6小时，本菌在此平板上产生乳光反应，易于识别。选取菌落数在30左右的平板进行计数。

46、计数后从中挑取5个可疑菌落进一步做证实试验。根据证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平皿内的蜡样芽孢数，然后乘上稀释倍数即得每克样品中所含蜡样芽孢杆菌数。如10-4稀释液的 平皿内菌落数为25个，取5个鉴定，其中4个证实为该菌，则1克检样中的蜡样芽孢杆菌数为：254510410=21062)倾注平板计数法：同消毒灭菌。一般认为蜡样芽孢杆菌每毫升或每克食物中的活菌数大于105时，即有可能发生食物中毒。4.形态观察：将平板上的可疑菌落进行涂片革兰染色可见革兰阳性大杆菌、两端稍钝圆、多数呈链状排列，少数有单个、成双或不规则排列。卵圆形的 芽孢位于菌体中央或次极端，不突出菌体。鞭毛染色可见有周鞭毛，无荚

47、膜。5.菌落观察：将可疑食物或培养物加适量生理盐水研磨后划线接种于普通营养琼脂平板和血琼脂平板上，经35孵育18-24h后观察菌落。在普通营养琼脂平板上形成圆形、凸起、表面粗糙、边缘呈扩散状、不透明的菌落，应光看呈白蜡状；在血琼脂平板上出现的菌落呈浅灰色似毛玻璃状外观，并有明显的草绿色或透明的溶血环。在卵黄琼脂平板上由于产生卵磷脂酶分解培养基中的卵磷脂，菌落周围形成乳白色混浊环。6.生化反应（1）碳水化合物试验：将普通营养琼脂平板和血琼脂平板上的单个可疑菌落分别接种到葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、微量发酵管和葡萄糖蛋白胨水，枸橼酸盐培养基上，35孵育18-24h后观察结果。该菌能分解葡萄

48、糖、麦芽糖、蔗糖，不分解乳糖、甘露醇、木糖，不产生吲哚，触酶、VP试验阳性。枸橼酸盐利用试验阳性。（2）含氮化合物试验：将可疑菌落分别接种到明胶培养基，经35孵育18-24h后观察结果。该菌可液化明胶。（3）乳光反应：1）原理：本菌能产生卵磷脂酶，在有Ca2+存在时，能迅速分解卵磷脂，生成甘油酯和水溶性磷酸胆碱，故在菌落周围出现乳白色混浊环，称乳光反应或卵黄反应。2）方法：用接种针挑取可以菌落点种在10%卵黄琼脂平板上，35孵育3h。3）结果和意义：3h无菌落生长，但在点种处可出现混浊环，6h后混浊环直径可扩大至5-6mm。用于测定细菌能否产生卵磷脂酶，也可以此来计数菌落。（4）触酶试验：阳性

49、7.肠毒素测定：通过动物实验测定。本菌与枯草芽孢杆菌的不同点是不分解木糖，与炭疽芽孢杆菌的不同点是能迅速液化明胶，利用枸橼酸盐。附录10%卵黄琼脂（1）成分：50%卵黄盐水20ml，pH7.4营养琼脂100ml（2）配置方法：将营养琼脂加热熔化，待冷却至55左右，以无菌技术加入50%卵黄盐水悬液，混匀后倾注于无菌平皿内，凝固后置4备用。（3）用途：用于测定蜡样芽孢杆菌的脂酶。实验7 铜绿假单胞菌的检测目的要求掌握铜绿假单胞菌检测的主要步骤与方法。熟悉化妆品标本的采集原则。掌握铜绿假单胞菌菌落的观察和生化反应结果的判断。器材和试剂1样本 可疑化妆品2培养基及试剂 SCDLP液体培养基、普通营养琼

50、脂平板、血琼脂平板、麦康凯平板、KIA、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基、明胶培养基、麦芽糖、木糖微量发酵管、硝酸盐培养基、枸橼酸盐培养基、葡萄糖蛋白胨水、肉汤培养基等。1%盐酸二甲基对苯二胺（氧化酶试剂）、硝酸盐还原试剂、吲哚试剂、3%过氧化氢、氯仿、1mol/L的盐酸3其他 接种环、接种针、载玻片、革兰染液、香柏油、擦镜液、生理盐水。步骤和方法一、样品的前处理1.亲水性样品（水包油型）：可取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水中，如样品量少于10ml，仍按10倍稀释法进行。如为5ml则加45ml灭菌生理盐水，混匀后，制成1：10稀释液。2. 疏水性样品（油包水型）：取样品10g先加10ml

51、灭菌液体石蜡混匀，再加10ml灭菌的吐温80，在40-44水中振荡混匀10min，加入灭菌生理盐水75ml，在40-44水浴中乳化，制成1：10悬液。或用均质器，将加有助溶剂、稀释液的样品放入均质器，均质3-5min后，取上清液待检（上清液的稀释倍数为1：10）。3.膏、霜、乳剂半固体状样品1）亲水性样品取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放30-32水浴中静置15min，用其上清液作为1：10的稀释液。2）疏水性样品称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，在40-44水

52、浴中充分混匀，制成1：10稀释液。4.固体样品：取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放30-32水浴中静置15min后取出，充分振荡混匀，再放到30-32水浴中静置15min，取上清液作为1：10的稀释液。如有均质器，上述亲水性膏、霜、乳剂等，可称10g样品加90ml的灭菌生理盐水，均质1-2mi；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品加90mlSCDLP液体培养基，或1g样品加1ml灭菌液体石蜡、1ml灭菌吐温80、7ml灭菌生理盐水，均质3-5min。二、增菌培养：取1：10稀释样品10ml加入90mlSCDLP液体培养基中，置37培养18-24h，进行增

53、菌。如有铜绿假单胞菌生长，则培养基表面有一薄层菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色。三、分离培养：从増菌液的菌膜处挑去培养物，划线接种于普通营养琼脂平板、麦康凯平板、十六烷三甲基溴化铵平板和血琼脂平板上，经35孵育18-24h后观察菌落特征及色素等。本菌为专性需氧菌，在普通营养琼脂平板上形成圆形、大小不一、边缘不整齐、扁平、光滑、湿润而常呈融合状态的 菌落，琼脂被染成蓝绿色或黄绿色。在血琼脂平板上形成大而扁平、湿润、有金属光泽、有生姜味的 灰绿色或蓝绿色菌落，菌落周围出现的菌落呈有透明的溶血环。在麦康凯平板上形成微小、半透明菌落，48h后菌落中央常呈棕绿色。十六烷三甲基溴化铵平板具有较强的选择性，大肠

54、埃希氏菌不能生长，革兰阳性菌生长较差而铜绿假单胞菌则生成无定型扁平菌落，向周边扩散或略有蔓延、表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。四、形态观察：将可疑菌落进行涂片革兰染色可见革兰阴性球杆状或长丝状，成双或成链排列。不染色标本动力观察，运动活跃；鞭毛染色，一端有1-3根红色的鞭毛。五、生化反应：将上述几个平板上的可疑菌落接种到各种生化培养基中。1.氧化酶、触酶试验、本菌均阳性。2.绿脓菌素提取试验：本来应该用专门的绿脓菌素培养基提取，但效果不如在十六烷三甲基溴化铵平板上提取，所以采用十六烷三甲基溴化铵平板，具体方法为在十六烷三甲基溴化铵平板中加入3-5ml氯仿，轻轻振摇2分

55、钟左右，当氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移至另一试管中，并加入1mol/L的盐酸1ml左右，震荡片刻后静止，如上层盐酸层液内出现粉红色为阳性，表明有绿脓菌素的存在。3.42生长试验：挑去纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放41-42培养箱中，培养24-48h。铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。4.其他生化反应：铜绿假单胞菌的最后鉴定，主要根据生化反应特征，与嗜麦芽窄食单胞菌的生化区别如下表1。铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌主要生化反应结果 KIA 氧化酶 枸橼酸盐 硝酸盐产氮 吲哚 色素 葡萄糖 麦芽糖 木糖细菌 底层 斜面 产气 H2S铜绿假单胞菌 - - -

56、 - + + + - + + - +嗜麦芽窄食单胞菌 - - - - + - - - - + + -检验结果报告：被检样品经增菌分离培养后，在分离平板上有典型或可疑菌落生长，经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，可报告被检样品中检出有铜绿假单胞菌。如绿脓菌素试验阴性，而液化明胶、硝酸盐还原产气和42生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。实验8 物体表面乙型肝炎表面抗原的检测目的要求熟悉和掌握对物体表面乙肝病毒HBsAg检测的原理和方法，目的是调查和了解物体表面被HBsAg污染的范围及程度，考核物体卫生学及消毒效果等，对于流行病学调查和保护人群健康具有重要意

57、义。器材和试剂1试剂 乙肝五项检测试剂盒(包括预包被反应条、酶结合物、HBsAg的阴阳对照血清、浓缩洗涤液、显色剂（A、B）、终止液、封口胶纸、稀释液)2.其他 酶标板、吸水纸、酶标仪、微量移液器、移液头、振荡器、恒温水浴箱等原理：酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种固相酶免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，与待测样品中的抗原或抗体发生反应，再加入酶标抗体与免疫复合物结合，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度（A）值的大小进行定性或定量分析。该试验的检测类型有双抗体夹心法、间接法、双位点一步法、竞争法和捕获法等。双抗体夹心法：属于非竞争结合测定，是检测抗原最

58、常用的方法，适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本原理是先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；加入待测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤除去其他未结合物；然后加入酶标抗体并温育。使固相抗体抗原复合物与酶标抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物（双抗体夹心），洗涤除去未结合酶结合酶标记抗体；加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量检测。步骤和方法一、样本采集：用棉拭子蘸1%血清磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.4），对医院门把手、水龙头和医疗器械等表面涂抹10次，对桌面、样品台、床头柜等

59、用规格板涂抹采样100cm2。将棉拭子浸入1.5ml磷酸盐缓冲液中，带回实验室。将样品置40C冰箱内过夜，取浸出液用酶联免疫吸附实验检测HBsAg。 二、检测步骤1.实验准备：从冷藏环境中取出试剂盒，在室温下平衡30分钟，同时将浓缩洗涤液作1：20稀释。2.加待测标本：在反应板中加入待测血清每孔50微升，注意应同时做阴性、阳性和空白对照。3.加酶结合物：每孔50微升，空白对照孔不加，充分混匀，置370C温育30分钟。4.洗板：1）手工洗板：取出反应板，甩去孔内液体，在滤纸上拍干。然后用洗涤液注满每孔，静置5-10秒，弃去孔内洗涤液拍干，如此反复5次、拍干。2）洗板机洗板：选择洗涤5次的程序洗板

60、，最后拍干。5.加显色剂：先加显色剂A，每孔50微升；再加显色剂B，每孔50微升，充分混匀，放置370C避光孵育15分钟。6.终止反应：每孔加入终止液50微升，混匀。结果判定1.肉眼观察结果：空白对照和阴性对照不显色（或有颜色变化），阳性对照出现明显的颜色变化，说明实验成立。受检标本显色深于阴性对照者可判为阳性。2.酶标仪判定结果：采用反应底物的最大吸收波长测定各孔吸光度值，本实验底物为TMB，最大吸收波长为450nm，因此在450nm波长测定吸光度值。以样本孔吸光度值（S）/阴性对照孔吸光度值（N）2.1时判定为阳性。注意事项1.试剂使用前应摇匀，并弃去1-2滴后垂直滴加，注意均匀用力。2.