小肽饲料专题

1、小肽饲料专题主要内容肽的概念及分类小肽营养理论的提出小肽的吸收机制、特点及影响因素蛋白质品质与肽的释放小肽的代谢小肽的营养作用小肽的应用研究生物活性肽小肽的制备方法一、肽的基本概念及分类肽：由两个或两个以上氨基酸通过肽键连接而成的化合物。肽键(peptide bond)： 一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱去一分子水缩合形成的共价键/酰胺键称为肽键。多肽(polypeptide)： 20个以上，分子量在10000道尔顿以下寡肽(oligopeptide)： 10-20个氨基酸小肽：10个氨基酸以下、基本概念、肽的分类（）按其来源可以分为:内源性生物活性肽: 如内啡肽、脑啡肽、胸腺肽等；

2、外源性生物活性肽：存在于天然蛋白质中的氨基酸序列。、肽的分类外源性活性肽与内源性活性肽的活性中心序列相同或相似，可通过体外生物技术被释放或合成出来；外源性活性肽通过直接与肠道受体结合，参与机体的生理调节作用或被完整吸收进入循环，从而发挥与内源性活性肽相同的功能。（）按功能可分为：功能肽：具有生理活性的肽，包括抗微生物肽、如短杆菌肽、神经活性肽、激素调节肽 如L一内啡肽、氧化肽、免疫活性肽等 结构肽：具有营养功能，参于细胞的代谢活动、细胞的构建、蛋白质的合成和细胞生长营养等。（）按其原料来源可分为：乳肽、大豆肽、玉米肽、花生蛋白肽、畜产肽、 水产肽、丝蛋白肽等等二、小肽营养理论的提出1、经典蛋白

3、质代谢理论 蛋白质在消化道内经蛋白酶和肽酶的作用降解为小肽和游离氨基酸，而小肽必须进一步降解为游离氨基酸才能被吸收利用。2、传统的蛋白质代谢理论面临挑战大量的研究表明：不同来源的饲料，尽管氨基酸组成相同但利用率存在明显差异（Elwell,1985). 动物对饲料中的氨基酸的利用率并不完全受单一限制性氨基酸含量的影响，即不遵循“木桶理论”。3、肽营养理论的提出当动物采食按理想氨基酸平衡配制的纯合日粮或氨基酸平衡的蛋白质日粮时，并不能获得最佳的生产性能；（Kephart,Sherritt,1991)因此，一些学者提出肽能被直接吸收的观点，并且肽营养理论被越来越多的人所接受。肽营养代谢的理论依据Ag

4、ar(1953)首先观察到肠道能完整地吸收转运双甘肽；Neway and Smith(1960)发现蛋白质在小肠内的消化产物除了氨基酸外，还有小肽，而且可以进入肠粘膜细胞；Drekcoop等人（1962）在血浆中发现存在含有羟脯氨基酸的肽；Adibi（1971）用双甘肽饲喂小鼠后，用同位素示踪法在血浆中检测到了这些肽；肽营养代谢的理论依据Hara等（1984）在兔小肠粘膜上发现了小肽载体；Fei（1992）克隆了小肽的I型载体；Adibi(1996)克隆了小肽的II型载体；Hong Chen等（2002）发现了鸡的小肽载体(cPepT1);小肽转运载体的种类和功能小肽转运载体的种类 酸性小肽转

5、运载体 碱性小肽转运载体 中性小肽转运载体小肽转运载体的种类和功能小肽转运载体PepT1的性质和功能 小肽载体对底物无选择性转运，不论小肽含有酸性、碱性还是疏水性氨基酸，PepT1都能跨膜转运至细胞。 三、小肽的吸收机制、特点及影响因素（一）、小肽吸收机制A、单胃动物小肽吸收机制三种形式：1.pH依赖性的H+和Na+转运体系，不消耗ATP。 小肽转运的动力来自质子的电化学梯度，质子向细胞内运输产生的动力驱使小肽向细胞内运输，由于小肽随质子进入细胞，引起细胞内pH值下降，从而活化了H+/Na+通道，H+被释放到细胞外，细胞内的pH值又恢复至原来的水平。 肽H+H+Na+Na+肽pH肽载体细胞内细

6、胞外具有pH依赖性的Na+/H+ 交换转运机制A、单胃动物小肽吸收机制2.依赖H+或Ca+2浓度的主动运转机制，需要消耗ATP. 在一定H+ 的浓度下，囊泡膜刷状缘肽的主动转运加速,但在缺氧或在添加代谢抑制剂的情况下被抑制.A、单胃动物小肽吸收机制3.谷胱甘肽(GSH)转运系统，GSH的跨膜运输与Na+、K+、Ca2+、 Mn2+的浓度梯度有关。B、反刍动物小肽吸收机理：两种不同途径：即肠系膜系统和非肠系膜系统空肠、回肠、盲肠和结肠所吸收的物质进入肠系膜系统；其吸收机制与单胃动物吸收机制类似。瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃和十二指肠吸收的物质进入非肠系膜系统。 瘤胃和瓣胃是反刍动物肽吸收的主要部位，对

7、小肽吸收是不饱和被动扩散过程，瓣胃上皮细胞吸收能力要强于瘤胃上皮细胞B、反刍动物小肽吸收机理：动物肠系膜系统非肠系膜系统牛520130840羊494842774可见非肠系膜系统是反刍动物小肽吸收的主要途径反刍动物的小肽吸收 单位:g/d（二）小肽吸收特点速度快耗能低不易饱和各种肽之间运转无竞争性与抑制性小肽能促进氨基酸和氨基酸残基的吸收（三）影响小肽吸收的因素1.日粮因素 不仅蛋白质限饲(包括日粮限饲)，而且限饲期的长短及底物可影响氨基酸与肽的吸收水平。2、动物因素动物种类生理阶段年龄肠道部位3、小肽本身因素肽链长度与肽的氨基酸组成氨基酸残基构型与载体肽链长度与肽的氨基酸组成Ress(1988

8、)试验观察到二、三肽蛋白水解物吸收快于410肽的水解物。摄入肠道大于三肽以上的寡肽，肠道内胰蛋白酶、肽酶对其进一步水解似乎是吸收的主要限速步骤(Grimble和Silk,1989) 氨基酸组成肽的氨基酸组成也影响其吸收。Burston等(1972)报道，对以谷氨酰赖氨酸形式存在的谷氨基酸，大鼠肠道对其的吸收速度是以谷氨酰蛋氨酸形式存在时的两倍。氨基酸残基构型与载体赖氨酸与甘氨酸形成二肽时，赖氨酸处于N末端要比处于C末端吸收更快。而赖氨酸与谷氨酸形成二肽时，赖氨酸处于C端吸收更迅速(Burston等，1972)。一般L型比D型、中性比酸碱性肽更易吸收。小肽载体也对其吸收有一定影响，它对疏水性、侧

9、链体积大的底物，如含支链氨基酸、蛋氨酸或苯丙氨酸的肽，具有较高的亲和力，而对亲水性、带电荷的小肽亲和力较小(Matthews,1991)。4、保护剂的使用在湖羊日粮中添加乙酸钠后，瘤胃肽浓度提高19.69%，山羊日粮中添加离子载体后，瘤胃中肽的保护率提高20%，氮的总体消化率也显著改善(刘晓牧等，2000)。（四）寡肽吸收的研究方法1、体内法肠瘘法静脉（或肠道）灌注结合血管瘘法导管小肠提取食糜肠道安装桥式瘘管分析食糜中标记氨基酸的吸收率静脉或肠道灌注被测物肝门静脉安装血管瘘研究寡肽吸收规律门静脉导管门静脉分离完成插入门静脉导管固定导管和导线导管保护袋2、体外法体外肠环法体外外翻肠囊法做小肠环状

10、物培养肠环中灌注待测物观测其在肠环的吸收变化分割小肠片段外翻成囊状物放在含待测小肽的培养液中培养取出测定小肽在肠道黏膜的消失率和浆膜液中的出现率四、蛋白质品质与肽的释放氨基酸平衡的蛋白质易产生数量较多的寡肽，而劣质蛋白质则产生大量游离氨基酸和少量分子量大的肽片段饲喂动物性蛋白有较大比例小肽，饲喂植物性蛋白有较多游离氨基酸饲料蛋白的小肽释放量与有效氨基酸和碱性氨基酸呈正相关 相关研究报道乐国伟等(1996)对几种不同动、植物性蛋白质饲料的胃蛋白酶和胰蛋白酶水解产物分析表明，寡肽的释放量由大到小依次为：酪蛋白、鱼粉、蚕蛹、豆粕、豆饼、菜籽饼、玉米蛋白粉，饲料蛋白质的寡肽释放量与有效赖氨酸(Alys

11、)呈正相关。刘选珍等(1996)的试验也表明：饲料寡肽释放量与碱性氨基酸含量相关的蛋白质呈正相关。由这些试验可以看出，必需氨基酸含量高且平衡的优质蛋白在消化过程中容易水解生成分子量低而数量多的寡肽，而必需氨基酸缺乏、不平衡的饲料蛋白质则产生数量少、分子量大的肽(Meister,1987)。 五、小肽的代谢.血液循环中小肽的来源消化道吸收（主要来源）体蛋白分解机体合成：肽类激素、脑啡肽等生理活性肽类肠外营养方式：皮下、肌肉、静脉注射等2、肽对组织蛋白质代谢的影响以小肽形式作为氮源的饲粮，其整体蛋白质沉积效率高于相应的以氨基酸或整体蛋白质作为氮源的饲粮。小肽的快速吸收和继而产生的代谢调节作用，是影

12、响组织蛋白质代谢的重要原因六、小肽的营养作用.促进蛋白质的合成循环中的小肽能直接参与组织蛋白质的合成。大鼠肌细胞、牛乳腺表皮细胞(Pan等，1996)以及羊肌源性卫星细胞(Pan等，1998)均能有效利用含蛋氨酸的小肽作为氨基酸的来源，用于合成蛋白质和细胞增殖。此外，肝脏、肾脏、皮肤和其它组织也能完整地利用小肽(Backwell等，1996；Hubl等，1994；Pierzynowski等，1997)，其中肾脏是消化循环肽和再捕获氨基酸的主要场所(Adibi,1997)。.避免氨基酸之间的吸收竞争 Rubino(1971)发现，小肽与游离氨基酸不相互影响彼此的吸收。Pharagyn和Barle

13、y(1987)报道，当赖氨酸与精氨酸以游离形式存在时，两者相互竞争吸收位点，游离精氨酸有降低肝门静脉赖氨酸的倾向；而后者以肽形式存在时，前者对其吸收则无影响。.对瘤胃微生物的营养作用 肽是瘤胃微生物合成蛋白质的重要底物，肽对瘤胃微生物生长的主要效应是加快微生物的繁殖速度，缩短细胞分裂周期。.提高生产性能 蛋白质在消化酶作用下降解产生具有特殊生理活性的小肽，能够直接被动物吸收，参与机体生理活动和代谢调节，从而提高其生产性能。Parisini等(1989)在生长猪日粮中添加少量的肽后，显著地提高了猪的日增重、蛋白质利用率和饲料转化率。Pocius等(1981)发现，黑白花奶牛吸收的谷胱甘肽在乳腺G

14、TPase的作用下降解为Gly与Cys，可作为乳蛋白合成的原料，促进乳蛋白合成。.促进矿物质元素的吸收利用 施用晖等(1996)报道，在蛋鸡日粮中添加小肽制品后，血浆中的Fe2+、Zn2+的含量显著高于对照组，蛋壳强度提高。Maria等(1995)报道，肉类水解物中的肽类能使亚铁离子可溶性、吸收率提高饲养试验表明：母猪被饲喂小肽铁后，母猪奶和仔猪血液中有较高的铁含量，而有机铁却无能为力，这表明，小肽对铁的吸收转运具有十分重要的作用。七、小肽的应用研究1.小肽在单胃动物中的应用研究1.1小肽与消化道消化酶活性能促进仔猪消化道发育,刺激消化酶的分泌与活性相关研究报道研究报道断奶仔猪Scheppac

15、h（1994）刺激小肠绒毛膜刷状缘氨基肽酶和二肽酶活性上升，还能提高小肽载体数量，从而增强动物的采食与消化吸收王恬(1998)日粮中添加小肽使仔猪十二指肠食糜中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性增强海鲈鱼鱼苗Zambonino Iufante（1997）绒毛膜中的胰凝乳酶和r-谷氨肽转氨酶的活性提高，氨肽酶活性降低1.2小肽与动物肠道黏膜形态结构实验动物作者研究结果断奶仔猪张军民（2000）日粮中添加Gln二肽显著增加空肠DNA含量，但对回肠和肠道蛋白无显著影响，可显著增加35日龄仔猪黏膜厚度和49日龄空肠绒毛高度，对十二指肠绒毛高度和黏膜厚度无明显影响。王恬(2002)日粮中添加小肽减轻断奶仔猪小

16、肠绒毛萎缩和隐窝加深的程度，促进肠道组织与功能发育。1.3 小肽与仔猪腹泻率汪梦萍(2002)给仔猪饲喂“喂大快”,试验组猪下痢头数明显减少.黄冠庆等(2003)报道,日粮中添加适量Gly-Gln能明显降低仔猪腹泻率.1.4 小肽与动物生产性能实验动物作者研究结果断奶仔猪汪梦萍（2002）试验组与对照组增重差异极显著，饲料转化率得到明显改善。育肥猪Lootekhniga等（1994）日粮中添加小肽提高产肉率和瘦肉率。泌乳母猪奶质量提高，减少母猪体重损失，使其泌乳量增加蛋鸡施用晖等（1996）产蛋率、日产蛋量和饲料转化率显著提高，蛋壳强度增强肉仔鹌鹑曹光辛（1998）促生长，体增重和饲料报酬明显

17、提高鳗鱼王碧莲（2001）饵料中分别添加2%和4%小肽，添加2%组比对照组生长率、摄食率和饲料效率都有提高。1.5 小肽与动物蛋白质合成代谢 小肽可直接被动物胃肠道吸收进入血液循环,刺激胰岛素的分泌,将血液中的葡萄糖迅速转移到肝脏,提高蛋白质的合成.Rerat等(1998)研究报道,向猪十二指肠灌注小肽后,血浆胰岛素的浓度高于灌注游离氨基酸组.Backwell(1994)应用同位素双标记技术,灌注的肽标记物能直接结合进入乳蛋白1.6 小肽与动物脂肪代谢小肽能阻碍脂肪的吸收，促进脂肪代谢1.7小肽与动物免疫功能正常小肽对细菌的屏障作用依赖于特殊因子（IgA）和非特殊因子（胃酸、肠蠕动、消化酶和正

18、常细菌群）张军民（2000）报道，在饲粮中添加1%-2%的谷氨酰胺二肽可明显降低早期断奶仔猪35日龄血液毒素含量，增加肠黏膜中S-IgA的浓度，防止有害微生物和毒素的易位，减少腹泻，增强机体应激能力。Jolle等（1981）研究表明，-酪蛋白水解产生的肽类，可以促进腹膜内巨噬细胞的体外吞噬能力。2.小肽在反刍动物中的利用研究2.1 研究热点2.1.1瘤胃微生物对肽的利用小肽主要是由瘤胃微生物的肽酶活性作用的结果（Wallace等1999）调控肽的降解速度，可使微生物更有效的利用氨基酸氮，对反刍动物氮存留率有利。肽分子量的大小影响其利用率：Broderick等1988研究报道，细菌对大分子肽的摄

19、取速度比对小分子肽和氨基酸的摄取速度快，大分子肽更易于转化为微生物蛋白。肽的组成成分影响瘤胃微生物对其利用 含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸和缬氨酸残基的疏水性肽在瘤胃液中代谢速度不快 含有大量带电氨基酸如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的亲水性肽的代谢比较稳定2.2 研究前景由于小肽的特殊吸收机制和营养作用，小肽在蛋白质营养中的作用越来越受到重视，但在反刍动物营养研究领域国内报道较少。国外虽然对其吸收机制有了一些报道，但对不同来源蛋白质饲料小肽在胃肠道消化、吸收和代谢规律以及对体氮沉积和体组织蛋白质周转研究较少。根据蛋白质水解终产物的小肽和氨基酸组成及吸收利用效率来正确评价蛋白质

20、饲料的营养价值，对于节约蛋白质饲料资源、减少氮对环境的污染，充分发挥反刍动物生产潜力具有重要意义。八、生物活性肽（Biologically active peptides，BAPs）1、概念 简称活性肽或功能性肽，是一类分子量较小、在构象上松散、具有多种生物活性作用的小分子肽类。2、生理作用调节动物的消化吸收提高动物免疫力提高动物抗感染能力促进动物生长发育促进矿物元素吸收3、生物活性肽的种类和来源（1）外源性生物活性肽1.1 阿片肽类研究最多最早的酪蛋白生物活性肽，是具有阿片活性的阿片肽。 Buantl等(1979)最先从-酪蛋白水解物中分离出了酪啡肽(-casomorphins)。它们是牛乳

21、-酪蛋白60-70氨基酸残基，其中活性最强的是五肽Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly。1.2 免疫活性肽免疫活性肽是继牛乳提取物中发现阿片肽后,第二个被发现的活性肽从人酪蛋白的胰蛋白酶-糜蛋白酶降解产物中分离得到的(Jolls等，1981，1982；Parker等，1984)，是激活巨噬细胞吞噬功能的肽。1.3、酪蛋白磷酸肽酪蛋白磷酸肽(CPs)分布于牛乳蛋白的不同区域，其活性中心是磷酸丝氨酸和谷氨酸簇。由于CPs在中性和碱性pH时，通过磷酸丝氨酸与钙、锌、铁等离子结合，由小肠肠壁细胞吸收后再释放出来，从而有效地避免了钙在小肠中性和偏碱性环境中被淀沉，促进了钙的吸收。 Sato用含有CPs

22、的食物饲喂大鼠，并在食物中加入同位素标记的钙，发现其大腿骨骼中的标记钙明显高于对照组。此后通过对大鼠、小鼠、鸡、猪的试验，都证明CPs具有促进钙、铁、锌吸收的功能(Hanson等，1997；Ashida等，1996)。 1.4、抗血凝肽Jolls等(1978)发现牛-酪蛋白与人纤维蛋白原-链具有结构的同源性。纤维蛋白原具有双重功能，它既参与血小板的凝集，又参与纤维蛋白的形成。1.5、抗高血压肽体外试验表明，有抑制活性的肽，位于人-酪蛋白3952氨基酸片段和人-酪蛋白6365片段，其中，人-酪蛋白4352片段(Ser-Phe-Gln-Pro-Gln-Pro-Leu-Iso-Try-Pro)在体内

23、活性最强。1.6、其它生物活性肽1.6.1 对环境有益的活性肽 谷物蛋白粉(CGM)经蛋白酶降解得到CGH(谷物蛋白水解物),具有抑制杂草根生长的作用,被认为是天然的除草剂.1.6.2 提高风味的肽用商品酶(Alcalase)水解脱脂的大米麸皮,从水解溶液中分离出具有调味功能的肽.2.内源性生物活性肽神经活性肽肠道分泌的肽胃泌素生长激素抑制素生长因子九、 小肽的制备方法 酸或碱水解制备 从生物体内分离提取 化学合成 DNA重组法 酶法分解 微生物发酵法酸或碱水解制备 优点:简单价廉 缺点:酸水解会破坏L-型氨基酸,使其转变为D-型氨基酸和有害物质碱水解产物有异味,水解难以控制生物体分离法： 从

24、动物腺体中分离，原料受限，分离困难，价格贵，难以大量生产；化学合成 优点:发展较早,技术成熟, 广泛应用于生产高价值的药用肽固相和液相两种分离方法 缺点:成本高,副反应和残留化合物多生产效率低生产中使用大量有毒溶剂,对环境和健康有害DNA重组法 优点:避免了化学合成法的缺点 缺点:在基因表达和回收上存在问题生产小肽的种类受到限制不适合制备短链肽酶法分解 优点:成本低所用基质和反应剂无害生产条件温和、高效、对蛋白质的营养价值破坏小，无异味反应具有空间立体性,产物没有消旋化现象,反应位点具有方向性，可定位生产特定的肽 缺点:蛋白酶的水解作用会产生许多不必要的产物缺乏合适的蛋白酶,产率低微生物发酵法国家发明专利技术，一种理想的生产方法；微生物发酵法工艺流程菌种保藏 菌种复壮 菌种活化 斜面菌种 摇瓶种子 培养基配制 一级种子 灭 菌 二级种子 冷 却 三级种子 培养基 发酵 浓 缩 粗分离 除渣 干 燥 分离 分析检测 提取 包 装 精制 （去除大分子 、去除小分子杂 质、 离子交换、 活性炭脱 大豆肽产品 色、单肽提取、 浓缩 、干 燥）微生物发酵发明专利技术微生物发酵法生产大豆活性肽工艺技术 国家专利技术号:ZL 0