克隆载体课件

1、基因克隆载体DNA克隆载体或基因克隆载体：将外源DNA带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子DNA克隆载体必须具备的主要条件:(1)至少有一个多克隆位点(MCS)，供外源基 因插入(2)自我复制(3)具有可选择的标记基因(4)安全，不含有害基因第1节 质粒克隆载体一.质粒的性质 1.质粒组成与构型 质粒:染色体外裸露的双链DNA分子 广泛存在于细菌，在真菌、蓝藻、绿 藻中也有发现 大肠杆菌质粒特性分:F型、S型、Col型 构型:超螺旋共价闭环(ccc-DNA)、开环 (oc-DNA)、线形(l-DNA)2.质粒的大小 100kb 相当于染色体大小的3%4.质粒DNA的复制质粒复制考贝数控制

2、原理:Cop基因编码阻遏蛋白，结合复制起始位点a.严紧型(stringent plasmid): 拷贝数少(1到几个)b.松弛型(relaxed plasmid):拷贝数较多(10个以上)松弛型质粒施加氯霉素可大量扩增质粒 氯霉素抑制蛋白合成，影响了基因组 DNA的合成5.质粒的不亲合性: 亲缘关系较近的质粒一般不亲合 解释1: inc基因合成质粒复制阻遏物 解释2: 膜结合位点饱和6.质粒迁移结合质粒(conjugative plasmid) 含有tra基因，指令宿主形成菌毛(pilus) 如: 质粒F、Ti、ColV2和IncP等非结合质粒(non-conjugative plasmid)

3、 本身不含tra，不会自行结合转移 如：质粒ColE1、pPbS等迁移作用(molilization): 有些非结合质粒，本身含有bom(oriT)位点, 当同时存在mob基因(或存在于辅助质粒上)，借助于tra基因产物，使非结合质粒转移到受体菌中7.显性质粒和隐蔽质粒显性质粒:R:抗抗菌素的质粒 Ap或Amp、Cm或Cmp、Km或Kan、Tc或TetF:引起细胞结合的育性质粒Col:产生大肠肝菌素(colicins)的质粒Ti:致植物冠瘿瘤的质粒二. 构建克隆载体的基本策略(1)具有有效的复制起始位点(Ori) 松弛型最好(2)多克隆位点(MCS)(3)标记基因(4)DNA分子尽可能小(5)

4、可组装特殊元件 表达型(带有启动、终止序列)、 同源重组型三.质粒克隆载体的构建1.大肠杆菌质粒克隆载体pBR322来源: 由质粒ColE1衍生的pMB1为出发质粒pMB1的特点:含有ColE1的松弛型复制起始位点缺少好的选择标记基因缺少较好的克隆位点pBR322的构建(1)保留ColE1的松弛型复制起始位点(2)pSF124中Apr(3)pSC101中Tcr 在抗性基因中带入合适的酶切位点(4)缺失迁移蛋白mob基因，但保留了bom位点pUC18/19pBR322的Tcr被乳糖操纵子一段DNA取代启动子、调节因子、-半乳糖苷酶的-肽基因(lacZ)-改造含MCS蓝白斑筛选(互补)LacZ基因

5、的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（ -互补） IPTG(异丙基-D硫代半乳糖苷)诱导下，作用底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷) ,使菌落呈蓝色2.农杆菌Ti质粒克隆载体构建Ti质粒(tumer inducing plamid):根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有的一种质粒，当农杆菌与植物接触时，会引发植物产生肿瘤(冠瘿瘤)双链DNA分子，大小在200-250kbp之间根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)

6、、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型（agropine）、农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)Ti质粒可分为四个区:(1)T-DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段 DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。约25kbp。 T-DNA左右边界(LB、RB)：25bp正向重复序列 右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有 所变化。其核 心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及 4bp(GTAA

7、)两部分,是完全保守的。 内部为:ocs、nos、引发肿瘤相关基因(Onc基因)(2)Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒区。 T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。(3)Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之 间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。(4)Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的

8、自我复制，故称之为复制起始区。双元载体系统（binary vecter） ：由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（trans vecter）双元载体系统的构建原理(1)双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti 质粒和辅助Ti质粒(2)Ti质粒上的Vir基因与T-DNA具有反式互 补作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的 转移。其次，中间载体含有广泛寄主范围 质粒的复制起始点（oriV），而代替了共 整合载体中用以重组的同源区，能够在任 何农杆菌寄主里自发复制。TA克

9、隆载体第2节 病毒(噬菌体)克隆载体病毒：DNA（或RNA）和外壳蛋白噬菌体：感染细菌的病毒病毒与宿主关系来分：温和型病毒构建载体的好材料烈性病毒通过改造，也可用于构建载体一. 噬菌体溶源性细菌特点：超感染免疫性溶原性细菌诱发进入溶菌周期att位点 attL attR噬菌体插入大肠杆菌基因组方式Champbell模型噬菌体粘末端结合成的双链称为Cos位点构建噬菌体的基本策略与技术路线：(1)去除非必须区 噬菌体包装: 大小51-36.4kb之间 野生型大小为48.5kb 去除非必须片断(复制、裂解等非必须)， 使包装片断尽可能大 同时，抹去一些酶切位点插入型载体 替代型载体 gtWESB替换型

10、： 最大可达15.5 最小0.7kb插入型： 不大于10.6kb(2)标记基因 Spi- ：外源取代red、gam基因 lacZ基因: 蓝白斑(3)建立外包装系统 转染(transfection)：裸露DNA 转导(transduction)：包装后，噬菌体颗粒介导宿主细胞中噬菌体的包装过程头部:E蛋白占72%：头部主要组成成分 琥珀突变导致尾部蛋白积累D蛋白占20%: DNA进入头部前体以及头部 成熟作用 琥珀突变导致头部蛋白积累D基因缺失突变株(D-): 溶原菌菌株BHB2690E基因缺失突变株(E-) 溶原菌菌株BHB2688 噬菌体克隆载体的应用(1)构建cDNA文库(2)克隆外源目的

11、基因二.粘粒(cosmid)噬菌体克隆外源DNA能力，最大23kbp，较为有效的克隆为15kbp在研究基因组功能时，需要更大克隆能力的载体，于是，提出cosmid粘粒定义:包含噬菌体cos位点的质粒，因此，质粒DNA在体内可以被噬菌体衣壳蛋白包裹。包含cos两端280bp以上的序列以及包装相关序列。剩余部分为质粒，具有质粒的性质。进行有效包装，插入片断后，总大小要在36.4-51bp之间粘粒的特点:(1)具有部分噬菌体特点 体外包装后，高效转导敏感型大肠细胞， 进入后环化(2)具有质粒特点 复制、抗性(3)高容量克隆能力 极限可达45kbp噬菌体包装必备条件:cos位点末端酶(teminase

12、)第3节 染色体定位整合载体染色体定位整合平台系统(gene integration platform system)整合平台：外源DNA整合位置克隆载体: 除一般质粒特征外，具有与整合 平台同源的DNA序列 基因打靶(gene targeting)基因定点同源重组(site-specifichomologus recombination)定位整合克隆载体的几种模式:(1)内源平台双交换置换克隆载体(2)外源平台双交换置换克隆载体(3)内源平台双交换插入克隆载体(4)内源平台单交换插入克隆载体定位整合克隆载体的定位整合效率(1)受体细胞(2)同源DNA片断长短总体上整合效率偏低第4节 人工染色

13、体克隆载体大片段克隆载体 显著特点是载体的容载能力扩大,约100350kb,主要有:酵母人工染色(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)源于噬菌体P1的染色体(Pl2derivedartificialchromosome,PAC) 酵母人工染色体(YAC)YAC 载体的复制元件是其核心组成成分:大肠杆菌中复制起始位点(ori)其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝

14、粒 （centromere , CEN）两个端粒（TEL） 筛选主要是营养缺陷型YAC载体的突出特点是容载能力大动物的YAC文库平均插入长度达9001000kb植物YAC文库平均插入片段一般为100350kb 构建基因组文库时,只需要较少的克隆数便可以覆盖整个基因组,使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱成为可能,基因组计划得以顺利实施。 缺点: (1)存在嵌合现象(chimerism)(2)YAC克隆的稳定性差 (3)插入片段的分离和纯化困难 (4)转化效率低 细菌人工染色体(BAC)在大肠杆菌F因子的基础上发展而来的, 其复制是严谨型的,在每个细胞中仅有12个拷贝,减小了插入片段发生重组的机率,并且F因子能够携带1