临床免疫学与检验：第六章 沉淀反应

1、第六章 沉淀反应chapter 16 PrecipitaonImmunology .免疫学沉淀反应沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反应。1897年Kraus发现，细菌培养液与相应抗血清混合时可发生沉淀反应。1905年Bechhold把抗体放在明胶中，将抗原加于其上，发现沉淀反应可在凝胶中进行。1946年Oudin报告试管免疫扩散技术。1965年Mancini建立单向免疫扩散技术。20世纪70年代免疫比浊法出现，沉淀反应快速、微量和自动化建立第一节 液相沉淀反应liquuid phase precipitation液相沉淀试验是指可溶性抗原与相应的抗体在含电解质的液体介质中反应，

2、形成肉眼可见的沉淀物的试验。分为：絮状沉淀试验、环状沉淀试验、免疫浊度分析。一、絮状沉淀反应原理：将抗原抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原于抗体结合，形成絮状沉淀物。 技术类型： 1.抗原稀释法（Dean-Webb 法） 2.抗体稀释法（Ramon 法） 3.棋盘格法（Checkerboard 法)1.抗原稀释法（Dean-Webb ）抗原稀释法（DeanWebb法）是将抗原作一系列稀释，与恒定浓度的抗血清等量混合，室温或37反应后，形成的沉淀物的量随抗原量变化而不同。离心沉淀后，分别测定沉淀物总量和上清中游离的抗体或抗原量。沉淀物产生量最多，上清中无反应过剩物的AbAg比例，即为最适比

3、。表16-1系以牛血清白蛋白为例的实验结果。表表16-12.抗体稀释法抗体稀释法（Ramon法）是将恒定量抗原与不同程度稀释的抗体反应。计算结果同上法，得出的是抗体结合价和抗体最适比。3.棋盘格法为了同时取得抗原与抗体的最佳比例，可将以上两法结合，即抗原和抗体同时稀释，称为棋盘格法（亦称方阵法），找出最佳配比。举例见表16-2。表16-2 最适比的方阵测定法二、环状沉淀试验原理：将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面，抗原与抗体在两液交界面处特异性结合，形成白色沉淀环。Ascoli 1902年创立抗原抗体沉淀环 方法学评价：该方法操作简便、快速。敏感性低（3-20mg/L)，只能定性。主要用

4、于鉴定微量抗原，如鉴定血迹，诊断炭疽。现在很少使用。第二节 凝胶内的沉淀试验Gel phase precipitation凝胶内沉淀试验是将可溶性抗原和相应抗体分别放入凝胶内进行扩散，两者在比例合适的位置形成肉眼可见的沉淀环或沉淀线。常见的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶。凝胶内的沉淀试验类型一、单向扩散试验（single gel diffusion) 1.试管法 2.平板法二、双向扩散试验(double gel diffusion) 1.免疫电泳 2.对流免疫电泳 3.火箭免疫电泳 4.免疫固定电泳一、单向扩散试验1.试管法 1946年Oudin首次报道。将抗血清或纯化抗体混入约5

5、0oC的0.7%琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，带凝固后，在凝胶上面加入抗原溶液，让抗原自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环。 本法多用于排泄物和组织均匀浆中的细菌、寄生虫、螺旋体等抗原的检测。沉淀线 图16-1 2种抗血清形成的沉淀线示意图AgAb一、单向扩散试验二、平板法 1.原理：待测抗原从局部含有相应定量抗体的凝胶内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在两者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原的浓度呈正相关。2.技术要点：将抗体或抗血清混入0.9%的琼脂糖内，未凝固前倾注呈平板，凝固后在琼脂板上打孔（直径约3-5mm），孔中加入抗原溶液，放室温或37oC

6、让其向四周扩散，2448后可见孔周围出现沉淀环。3.数据处理1.Mancini曲线：适用于大分子抗原和长时间扩散（48h)的结果处理。使用方格计算纸划线，扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C/d2=K3.数据处理2.Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间（24h)扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与扩散圈的直径之间呈线性关系。公式表示：logC/d=KlogC4.临床应用常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等定量测定。二、双向扩散试验1.原理：将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，让两者在凝胶内自由扩散，当抗原与抗体相遇，浓度比例适当处形成可见的白色沉淀线

7、。 2.技术要点将加热融化的琼脂倾注一均匀的凝胶薄层，待琼脂凝固后，在琼脂胶板上打孔，在相对应的孔中分别加入抗原或抗体，置室温或37 18-24小时，观察沉淀线。3.方法评价是抗原抗体鉴定的最基本的方法之一。本试验是一种稳定、简便的方法，不需要特殊仪器设备，重复性好，但灵敏度稍差（1.25mg/L)。4.临床应用1.抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估算 出现沉淀线，表明存在相应的抗原和抗体，不出现沉淀线则表明抗原或抗体的缺乏。沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；靠近抗体孔，提示抗原含量较多。出现多条沉淀绒，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，双向免疫

8、扩散可用于鉴定抗原或抗体的纯度。2分析抗原或抗体的相对分子量 抗原或抗体在琼脂内扩散的速度受分子量的影响。分子量大扩散慢，扩散圈小，局部浓度则较大，因此形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如二者分子量相等，则形成直线（图16-5）。抗体多为IgG，分子量约150kD，据此可粗略估计未知抗原的分子量。图16-53用于抗原性质的分析 两种受检抗原的性质可完全相同、部分相同或完全不同。在一块琼脂板上打三个孔，二个孔中加入抗原，一个孔中加入抗体，扩散后通过沉淀线的形态可鉴定两种抗原的性质（图16-6）。这种技术作为抗原的分析，是免疫化学中较常用的鉴定技术之一。图16-64用于抗体效价的滴定 双向扩散技术是

9、抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。图16-7第三节 免疫电泳技术免疫电用技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。两大优点：1.加快了沉淀反应的速度； 2.将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，在分别与抗体反应，以此作更细微的分析。免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique）是将免疫扩散和电泳相结合的一种免疫学分析技术。由Grabar与Williams于1953年创立，此项技术由于既有抗原抗体反应的高度特异性，又有电泳分离技术的快速，灵敏

10、和高分辨力，至今仍是免疫学的一项基本技术，广泛应用于生物医学领域。根据不同的实验目的和要求，在经典的免疫电泳技术基础上，又派生出很多新的技术和方法。一、免疫电泳是区带电泳与免疫双扩散的结合。1953年Grabar和Williams首先报道。根据各蛋白所出的电泳位置，可分为白蛋白区、球蛋白a1区、a2区、b区、区。图16-8其基本原理是将蛋白质抗原在琼脂糖凝胶上进行电泳，样品中不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异，而被分离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫扩散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比

11、例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。 图16-8血浆蛋白各区带位置示意图根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准（或正常）抗原、抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分的种类及其性质进行分析、鉴定。血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分二、对流免疫电泳原理 在琼脂板上打两排孔，左侧各孔加入待测抗原，右侧孔内放入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，带负电荷的抗原泳向阳极侧，而抗体籍电渗作用流向阴极抗原侧，在二者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线。+三、火箭电泳(Rocket immunoelectrophoresis)RIE:又称为单向扩散免疫沉淀技术。操作：在含抗体的琼脂板一端打一

12、排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距23mA/cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。用途：抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原呈正比，用已知量标准佐对照，可以测定未知标本中的抗体含量。火箭电泳示意图三、火箭电泳操作时的注意事项：1.所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的，否则，火箭形状不规则。2.注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈部清晰的云雾状或圆形皆提示未达到终点。3.标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后在加样。否则易形成宽底峰形，使定量不准。4.作IgG定量时，由于抗原和抗体的性

13、质相同，火箭峰因电渗呈纺锤状。以甲醛（与IgG上的氨基结合）甲酰化IgG纠正。四、免疫固定电泳（Immunofixation electrophpresis, IFE）IFE：将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与对应抗体直接发生反应，形成复合物嵌于固相支持物中。将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定的某种蛋白。区带电泳支持物选用滤纸、醋酸纤维薄膜、琼脂或聚丙烯酰胺皆可。常用于M蛋白的鉴定。法国SEBIA 全自动电泳仪HYDRASYS HYDRAPLUS 2 样品稀释准备系统 电泳仪第四节 免疫浊度分析技术Immunoturbidimetry20世纪

14、70年代建立。它是将液相内的沉淀试验与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。当可溶性抗原与相应的抗体特异结合，在二者比例合适、并有一定浓度的电解质存在时，可以形成不溶性的免疫复合物，使反应液出现浊度。这种浊度可用肉眼或仪器测知，并可通过浊度推算出复合物的量，即抗原或抗体的量。免疫浊度测定是定量测定微量抗原物质一种高灵敏度、快速的自动化免疫分析技术,其应用广泛。免疫浊度分析方法类型一、透射免疫比浊法二、速率抑制免疫比浊法三、散射免疫比浊法四、免疫胶乳浊度测定法一、透射免疫浊度测定法原理：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液过量时，形成的复合物随抗原量

15、的增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物质的含量。技术要点:1）抗原参考品及待测标本作适当稀释；2）将待测标本和标准抗原液（5个浓度）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处检测各管吸光度；（3）以剂量-反应曲线求得标本中抗原的浓度。入射光透射光散射光方法评价：本法操作简便，结果准确，能用全自动化或半自动化仪器进行分析。灵敏度低于散射比浊法，但比单扩散法高5-10倍。抗体用量较大，检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长。不宜用于药物半抗原的检测。二、散射免疫比浊法 1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的抗原抗体复合物微

16、粒上时，部分光线发生散射的原理，通过测量散射光的强度来得知待测抗原的量，这种比浊测定法称为散射比浊法（nephelometry）。1977年Sternberg进一步发展建立了速率散射比浊法（rate nephelometry），使微量抗原的定量测定得以快速灵敏地进行。基本原理 散射比浊法是指沿水平轴照射的一定波长的光，通过溶液时光线被免疫复合物粒子颗粒折射，发生偏转，产生散射光。反应溶液中的悬浮分子，无论是固体或胶体粒子都可以是散射中心。当入射光通过时，如果颗粒直径比入射光的波长小很多（入射光波长的1/101/20），则散射光在各个方向上的分布比较均匀，称为Rayleigh散射；粒径与入射光的

17、比例增大，正向散射光强度趋于增强，当粒径略小于入射光波长时，称为Debye散射；如果颗粒直径接近或大于入射光波长时，则散射光呈明显的不均匀分布，称为Mile散射。式中I为与入射光成角度处散射光的强度；和I0 分别为入射光的波长和强度；r为焦点至检测器的距离；N为散射粒子数（抗原抗体复合物的数量）；V为粒子的体积；n为粒子的折射率；n0为溶剂的折射率；为入射光与散射光的夹角。入射光波长越小，散射光越强；散射光强度与粒子的浓度和体积成正比；散射光强度随焦点至检测器距离的平方和而下降。 因此，在散射比浊中，增加抗原抗体复合物的体积，减少入射光的波长，将检测点尽可能地接近散射源并选择合适的检测夹角，都

18、可使检测的灵敏度增加。由于散射比浊法测定的是散射光的信号，避免了透射光中所含有的透射、散射甚至折射等杂信号成分的影响，因此，散射比浊法的灵敏性和特异性均好于透射比浊法。散射比浊法类型终点散射比浊法（end-point nephelomtry）速率散射比浊法（rate nephelometry）（一）终点散射比浊法抗原、抗体相遇后免疫沉淀反应立即开始，但反应达到平衡通常需1030min。免疫浊度测定应在复合物聚合产生絮状沉淀之前进行，否则光散射值降低，影响测定结果。因此，终点散射比浊通常是在免疫反应进行到一定时间时测量其浊度，故亦可称为定时散射比浊(fixed time nephelometry

19、)。（二）速率散射比浊法速率散射比浊法是一种先进的动力学测定法，1977年由Sternberg首先用于免疫学测定。所谓速率是指单位时间内抗原与抗体反应的速度。抗原与抗体结合形成免疫复合物的速度，在每个单位时间内是不相同的，在抗体过量的情况下，随着反应时间的延长，免疫复合物的总量逐渐增加，通常在25s时出现一个反应最快的速率峰。峰值与抗原量呈正相关。图16-13 抗原抗体反应的速率变化time散射光强度到达峰值时间三、速率抑制免疫比浊法rate inhibition immunoturbidimetry本法是一种竞争性结合或竞争性抑制试验，主要用于测定半抗原和药物等小分子物质。试剂中的特异性抗体

20、是由半抗原与载体蛋白偶联后，免疫动物制备而成。 试验时先将一定量的已知半抗原-载体（大分子）与限量的特异性抗体发生反应，生成的免疫复合物可形成一定的速率散射峰值。当反应系统内加入待检标本时，其中所含的半抗原（小分子）与抗体竞争结合，使大分子的半抗原-载体-抗体复合物的形成受到抑制，速率散射峰值降低，其降低程度与标本中的待测半抗原（或药物）成正比，根据标准曲线可计算出标本中待测物质的含量。四、免疫胶乳浊度测定法immunolatex turbidimetry原理： 将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，则使乳胶颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内不阻碍光线透过，两

21、个或两个以上胶乳颗粒凝聚时，则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳凝集的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比。五、免疫浊度分析的影响因素 抗原抗体反应的比例 抗体试剂的质量 抗原抗体反应的溶液 增浊剂的作用 （一）抗原抗体反应的比例浊度法中的免疫反应遵循抗原抗体反应的一般规律。免疫浊度测定的反应体系中必须始终保持抗体过量，以保证免疫复合物的生成量与浊度的改变一致，这是免疫浊度测定的基本原则。抗体过剩必须适量，因此实验中掌握抗体的浓度是个关键。 为了减少非特异性浊度（“伪浊度”）的出现，还应对抗原（待测样品）进行适当的稀释。（二）抗体试剂的质量 1抗体的质量：免疫比浊测定法要求抗体的特异性强，效价高，亲和力强。2抗体的类型 ：根据抗血清来源的动物种类不同，抗体可分为R型（rabbit type）和H型（horse type）。 R型抗体是用于免疫比浊测定的