定性免疫学检验的性能验证与质量控制课件

1、定性免疫学检验的性能验证与质量控制ISO15189实验室认可系列培训讲座1.第1页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xxISO15189认可中大家到困惑的问题 定性免疫项目如： ELISA检测、自身抗体免疫印迹试验、抗核抗体免疫荧光（IIF）检测质量控制和性能验证及验证内容？如何做？标准？2.第2页，共70页。3.第3页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx5.5.1.1 检验方法和程序的分析性能验证内容应参考试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，至少应包括：检出限、符合率（采用国家标准血清盘或临床诊断明确的阴阳性样品各20份或与其他分析方法比对），如为定量

2、方法应验证精密度（包括重复性和中间精密度）；并应明确检验项目的预期用途，如筛查、诊断、确认。5.5 检验程序CNAS-CL39：2012医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学检验领域的应用说明-2014改版4.第4页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx试剂盒说明书（先决条件！）国际和或国内标准性能验证的合格标准从何而来？5.第5页，共70页。6.第6页，共70页。7.第7页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx筛查试验诊断试验确认实验C50C5C95概念准备8.第8页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx筛查试验用于检测整个人群或部分人群中分

3、析物的存在情况。一般而言，筛查试验应当具有较高的临床敏感性（即临床检出率大于95%），对其特异性的要求（和阳性预测值）则取决于对各种因素的综合考虑。如粪便隐血检测筛查试验9.第9页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx用于临床怀疑某种特定疾病或状况是否存在。诊断试验需具有良好的敏感性和特异性。诊断试验后如需进行确认试验，对诊断试验的特异性要求可以稍微降低。如各种微生物培养诊断试验10.第10页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx确认试验用于验证筛查试验或者诊断试验结果的确认。对于确认试验，特异性比敏感性更为重要。如梅毒密螺旋体抗体荧光吸收试验（FTA-ABS）

4、确认试验11.第11页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。临界点（C50）浓度的定义C5012.第12页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx这里的C50指的是一个处于试剂检测临界点的样本浓度，其一旦确定，是不变的。试剂盒CUT-OFF值指的是一个判断某一次测定结果的由阴性和阳性对照信号值按一定公式计算出来的信号值，每次测定都会有所差异。C50与试剂盒阳性反应判断值（CUT-OFF值）的区别13.第13页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx一份样本，在多次重复实验

5、中有95%的几率获得阴性结果时该分析物的浓度。C5 浓度的定义C514.第14页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阳性结果时该分析物的浓度。C95 浓度的定义C9515.第15页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx应熟悉待验证的试剂或系统进行必要的培训，包括样本的处理和储存、试剂的处理和储存、合理的检测方案、对结果合理的解释以及系统的质量控制等。制定质量保证计划确定患者样本的数量及强弱（评价重复性）确定比较的方法性能验证专业知识技能准备16.第16页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx质控品：可

6、为商品质控品，有阳性和阴性。C50和可能的C5（低于C50浓度20%）及C95浓度样本（高于C50浓度20%） ：用于重复性及最低检出限验证，不少于40次检测量）临床样本或血清盘（准确性验证）（不少于50份阳性和阴性样本）样本准备17.第17页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx进行重复性研究时，理想情况下需绘制在规定条件下候选方法的整个不精密度曲线，然而具体操作时需要检测的样本数量较大可使用一个简单的方法，即为待评价的检测方法建立分析物的临界浓度，并判定某一特定浓度范围，例如C5020%，是否包含了C5-C95区间。若-20%到+20%浓度范围包含了C5-C95区间，那么2

7、0%或距离C50更远浓度的样本将得到一致的检测结果，即在 C5-C95区间之外的样本检测结果可认为是精密的，浓度C95，将持续得到阳性结果，浓度C5，将持续得到阴性结果。20%仅用于举例，实验室也可根据检验目的和可接受的精密度选择10%或30%。分析物浓度接近C50的定性方法精密度试验 18.第18页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx评价定性检测试剂或系统精密度时，需采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度。定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（亦即“灰区”），这一区间范围C5020%。只提供两种检测结果(

8、-/+)的定性检测的精密度19.第19页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线20.第20页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx两种不同方法的不精密度曲线比较21.第21页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界浓度，但需验证。如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得50%阳性和50%阴性结果的那个稀释度。这一稀释度的分析物浓度即为临界点（C50）。如何获得系统或试剂的“临界点（C50）”CLSI EP12-A2 User

9、 Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline22.第22页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xxC50是否准确？ 40次测试 C501阳性结果=27/40(67.5%)2阳性结果（14-26）/40（35%-65%）正确23.第23页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx不同C50重复检测次数与检出阳性数的关系24.第24页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx如何获得系统或试剂的“临界点（C50）”25.第25页，共70页。ISO1518

10、9实验室认可系列培训讲座xx26.第26页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx制备评价用样本 制备3份样本。一份浓度为C50，一份为C50+20%，一份为C50-20%。 每份样本的体积需保证40次或更多次重复检测的需要。评价方法 每份样本检测40次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。试验步骤 27.第27页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx-20%+20%浓度范围在C5-C95区间之内；用该方法检测，浓度超过C5020%的样本检测结果不一致；此结论错误率5% ，需使用更宽浓度范围的样本（如30%）进行另外的试验。 结果判断-1 28.第28页，共7

11、0页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx-20%+20%浓度范围包含了C5-C95区间；用该方法检测，浓度超过C5020%的样本检测结果一致结果判断-229.第29页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx用该方法检测，C50+20%的样本检测结果一致，C50-20%的样本不一定能得到一致结果；需要用低于C50更大百分率浓度的样本（如-30%）进行补充试验。结果判断-330.第30页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致结果；需要用高于C50更大百分率浓度的样本（如+30%

12、）进行补充试验。结果判断-431.第31页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx检测限（limit of detection）是指检测方法可检测出的最低被测量浓度，也称检测低限（lower limit of detection）或最小检出浓度（minimum detectable concentration），有时也称为分析灵敏度（analytical sensitivity）。如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以测出的最低被测量浓度。检出限的验证32.第32页，共7

13、0页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx评估试剂分析敏感性所使用的样本，如检测项目有国家参考品，则可使用国家参考品或经国家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品，则使用可以溯源或量化的样本，如国际标准物质，或与国际标准物质溯源的样本，是更有意义的。处于测定下限浓度（如C95）的样本，重复检测20次，应至少有18次以上为阳性反应。检出限的验证33.第33页，共70页。34.第34页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx概 述 特定的定性免疫测定系统或试剂的准确度以与临床诊断、金标准方法和经过验证确认血清样本盘的检测比较来评价，常以敏感性（包括临床敏感性）/特异性（包

14、括临床特异性）和阳性符合率/阴性符合率来表示。准确度验证35.第35页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率 （即出现阳性结果和确定患者患病）；注：该临床疾病必须由不依赖于被评价试验的标准确定。临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。临床特异性和临床敏感性36.第36页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx研究人群 有一些研究的人群，仅包括健康人群和疾病严重的人群，而忽略了介于两种状态之间的人群和一些不典型的患病人群。将这部分人群剔除在研究人

15、群之外，会优化评价的结果，造成试剂在实际应用当中结果简单明确的假象。因此，研究人群最好符合以下要求： 涵盖疾病的各个阶段； 涵盖一些不典型的、较难诊断的患病人群； 各组不同特征的人群均需有一定的数量。 总之，研究的人群要能够代表该检测系统或试剂预期使用的人群，否则给出的数据将存在偏倚。临床特异性和临床敏感性37.第37页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx阳性结果的可靠性（预示值）：即测定为阳性的标本实际上为阳性的可能性。 =真阳性/（真阳性+假阳性）100%阴性结果的可靠性:则为一份给出阴性结果的样本实际上为阴性的可靠性。 = 真阴性/（真阴性+假阴性）100%临床特异性和

16、临床敏感性38.第38页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx试剂的检测结果共计分析物阳性分析物阴性阳性结果数TPFPTP+FP阴性结果数FNTNFN+TN共计TP+FNFP+TNTP+FP+FN+TN敏感性100%特异性100%阳性预测值100%阴性预测值100%符合率100%注1:式中：TP分析物存在时检测结果为阳性的数量。FP分析物不存在时结果为阳性的数量。TN分析物不存在时检测结果为阴性的数量。FN分析物存在时检测结果为阴性的数量。 表1:敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算39.第39页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx作为筛查试验，检测的

17、敏感性应95%。作为诊断试验，检测敏感性和特异性均应95%。作为确认试验特异性应98%-99%。定性免疫检验项目敏感性、特异性要求40.第40页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx建议使用计分可信区间以上公式中，1.96是从标准正态分布对应的95可信区间得来的。若置信水平改变，则1.96也应被相应的百分位点所替代。41.第41页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx敏感性、特异性的计算举例表：待评价试剂与诊断标准相比较进行敏感性、特异性的计算举例待评价试剂的检测结果诊断标准分析物存在分析物不存在总计阳性结果数88290阴性结果数14336350共计102338

18、440敏感性=100%88/102=86.3%特异性=100%336/338 =99.4%敏感性和特异性的95%置信区间为敏感性(74.3%, 93.2%) 和特异性 (96.7%, 99.9%)。42.第42页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx概 述如果没有可用的诊断标准，那么厂家需提供待评价试剂与某一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下，则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率和阴性符合率。这种计算反映的并非方法的准确度，而是待评价试剂和已验证方法的一致性程度。阳性符合率和阴性符合率43.第43页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx表：待评价试

19、剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算阳性符合率和阴性符合率的计算待评价试剂的检测结果已验证方法+-+ab- cd共计a+cb+d阳性符合率= a/(a+c) 100%。阴性符合率= d/(b+d) 100%。 总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)100%。需要特别说明的是，阳性符合率可以解释为已验证方法检测结果为阳性的样本中待评价试剂的阳性率，44.第44页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx表：待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算举例阳性符合率和阴性符合率的计算举例待评价试剂的检测结果已验证方法总计+-+801090- 83423

20、50共计88352440阳性符合率= 80/88 100% = 90.9%。阴性符合率= 342/352 100% = 97.2%总符合率= (80+342)/440 100% = 95.9%95%置信区间为：敏感性(78.8%, 96.4%) 和特异性( 93.5%, 98.8%)。45.第45页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx每次实验，应立即记录所有原始检测数据并复核，以早期发现分析系统及人为误差的来源。一旦发现某些结果是由可解释的误差引起的，则应将其记录下来，同时，这些结果不能用于数据分析。如不能确定误差产生的原因，则保留原始结果。数据收集的检查 46.第46页，共

21、70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx第三方质控品检测系统配套质控品自制质控品质控品的来源5.6 检验结果质量的保证-室内质控47.第47页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx基质：应尽量选择人血清基质，工程菌或动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起非特异或中和反应造成假失控。稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水，避免使用动物源性的小牛血清等。稳定性：室内质控需要观察一段时间，一般选择生产者声明在一定保存条件下如2-8或-20以下有效期为6个月以上。要特别注意开瓶有效期和冻干质控物复溶后分装瓶的有效期与原装瓶有效期的区别，通常前二者的有效期

22、要短许多。实验室应对这些有效期进行验证。5.6 检验程序的质量控制质控物的选择 48.第48页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年的实验量。每分析批至少安排一个弱阳性和一个阴性质控，检测位置不能固定而应随机放置。试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CUT OFF值或阈值的，也有相应的有效性判断标准，但只能在同批号试剂内使用，不能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试剂间的变化的外对照。质控物的选择 49.第49页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx高值或超高值阳性血清是用来监控“HOOK效应”

23、的，应该在引进分析方法或试剂盒时评价，不需要长期监控，同时其测定值远高于CUT OFF 值对边缘结果的监控也无任何价值。质控物的选择 50.第50页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx质控品水平：阴性质控品：特定项目人阴性血清混合物（若为ELISA或CLIA质控品浓度宜0.5倍临界值左右）阳性质控品：特定项目人阳性血清混合物ANA 1:1000anti-dsDNA 1:100或以上anti-ENA 中强度阳性：若组合式检测，至少有2个项目为阳性质控物的选择 51.第51页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx质控品水平：弱阳性质控品：ELISA、CLIA：临界

24、值24倍的样本IIF:比临界值高1个滴度。特定项目人阳性血清或阴阳性血清混合物。ANA ：1：1001:320 ，ANA模型：斑点型，或均质型，或核仁型，或胞浆型等（可以每6个月变换，存储质控品至少有2个模型！）anti-dsDNA：1:101:32anti-ENA：低度阳性或临界值24倍的样本（若组合式检测，至少有2个项目为弱阳性）质控物的选择 52.第52页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx大量的临床免疫项目无商品化的质控物供应，实验室需自制，其步骤为：1 收集阳性血清(无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清)到一定量（至少够本室使用6个月以上的量）；2 传染性病原体需经5

25、6、10小时灭活后使用；3 0.2m生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；4 稀释，用正常人血清稀释；5 IIF方法ANA弱阳性质控品（均质型），将混合血清浓度调整到其临界值（1:100）或高1个滴度（1:320）或之间； 6 测定值，与定值参考品进行对比、求值，无参考品时选择在2-4倍Cut Off值附近的阳性值；6 分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20冻存备用；7 稳定性及瓶间差评价。自制质控品53.第53页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx不同保存条件下以数值计算方法：抽样方法同均一性 2-8：CV值、累计CV值，稳定期 -80：CV值、累计CV值，稳定期 室温：C

26、V值、累计CV值，稳定期以定性判定方法：抽样方法同均一性 2-8：滴度的符合率，累计符合率，稳定期 -80：滴度的符合率，累计符合率，稳定期 室温：滴度的符合率，累计符合率，稳定期质控品稳定性的评价1）均一性评估：同批号质控品随机抽取5支（瓶），80%符合为合格。2）稳定性评估：评估1周，1月，3月，6月，1年。有效期一般可标定为1年。54.第54页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx纯定性试验：如免疫印迹、斑点渗滤等，除膜条本身的内对照外：每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。质控判定规则阴性质控品的检测结果为阴性弱阳性质控品的检测结果为弱阳性纯定性试

27、验的质控要求如：抗ENA抗体谱检测55.第55页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx以滴度或稀释度判定的试验：如间接免疫荧光法、凝集试验等，每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。质控判定规则：阴性质控结果为阴性弱阳性质控结果在靶值上下一个滴度或稀释度纯定性试验的质控要求如：ANA、anti-dsDNA、ANCA、AMA、SMA等56.第56页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx用数值判定结果的试验：如ELISA、CLIA等。浓度：弱阳性质控品浓度宜在24倍临界值左右，阴性质控品浓度宜0.5倍临界值左右（两个水平）。频次：若是ELISA应

28、每板做质控，若是CLIA每分析批做质控。质控判定规则：至少利用其多规则中一个偶然误差及一个系统误差规则。12s警告，13s和22s失控。纯定性试验的质控要求如：anti-PR3、ACL、anti-CCP等57.第57页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx发现问题分析问题产生的原因采取纠正措施加以改进，进而预防验证和追踪 避免同样的问题出现第二次！失控原因分析及处理58.第58页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx阳性质控品失控的常见原因: 污染、温育时间不稳定、偶然误差。阴性质控品的常见失控原因：污染、洗板不干净、标本间的交叉污染。处理措施：全自动加样系统一

29、次性吸头的使用，洗板机的维护，洗液的定期更换，温育温度和温育时间的保证，加样器的准确，荧光显微镜的维护。失控原因分析及处理59.第59页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx微量加样器的质量保证60.第60页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx检定或校准：至少每年1次加样器的校准 可依据ISO/DIS8655文件和国家技术监督局颁发的有关定量、可调移液器的中华人民共和国国家计量检定规程定量、可调移液器试行检定规程（JJG646-90）规定的重量测试方法。这是目前用于此类仪器有效的校准方法。 微量加样器的质量保证61.第61页，共70页。ISO15189实验室认

30、可系列培训讲座xx测定波长：400-750nm吸光度范围：0.0-4.0，线性误差2.0%，精密度CV0.2%光学系统：垂直光路多通道（硅胶管或光导纤维）检测速度：数秒震板功能温育功能软件功能酶标仪的质量保证：酶标仪的性能62.第62页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx酶标仪校准至少1年1次，可由计量部门或厂家完成，实验室验证酶标仪的质量保证：酶标仪的校准核心：比色测定的 准确性 线性 精密性63.第63页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx荧光显微镜的质量保证稳定激发光优质光路光强校验64.第64页，共70页。ISO15189实验室认可系列培训讲座xx校准：至少每年1次，可有厂家完成，实验室验证汞灯：寿命一般200小时，及时更换正确使用：尤其开机、关机（两次开启光源间隔要在20分钟以上）荧光显微镜的质量保证65.第65页，共70页。ISO15189实