CRISPRCas9基因编辑技术在微生物细胞中的应用研究进展

1、应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol Doi: 10.19675/ki.1006-687x.2021.01051收稿日期 Received: 2021-05-16 接受日期 Accepted: 2021-08-17国家自然科学基金项目（31960023、32070106）、云南省自然科学基金面上项目（202001AT070075）、云南省中青年学术和技术带头人后备人才（2018HB05）、云南省万人计划“青年拔尖人才”项目（YNWR-QNBJ-2019-01）和云南大学生物资源保护与利用国家重点实验室开放基金项目（2019KF009）资助 Supported b

2、y the National Natural Science Foundation of China (31960023, 32070106), the Natural Science Foundation of Yunnan Province (202001AT070075), the Reserve Talents Project for Young and Middle-Aged Academic and Technical Leaders of Yunnan Province (2018HB05), the Young Top-Notch Talent program of Yunna

3、n Province (YNWR-QNBJ-2019-01), and the Open Fund of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan, Yunnan University (2019KF009)*通讯作者 Corresponding author (E-mail: )CRISPR/Cas9基因编辑技术在微生物细胞中的应用研究进展邓 名 丁俊美*云南师范大学生物能源持续开发利用教育部工程研究中心 昆明 650500摘 要 CRISPR/Cas系统（Clustere

4、d Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins）是原核生物中广泛存在的、用于抵御外源遗传物质入侵的获得性免疫防御系统。由II型CRISPR/Cas系统改造而来的CRISPR/Cas9技术，是继锌指核酸酶和转录激活样效应因子核酸酶后的第三代基因编辑技术。基于近年文献综述CRISPR/Cas9系统的发现、免疫防御过程和作用机制，并总结其在微生物细胞中的应用研究进展。CRISPR/Cas9系统由tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白组成的复合物识别PAM序列并行使切割功能，不同微生物来源的C

5、RISPR/Cas9系统识别的PAM序列存在差异；CRISPR/Cas9技术对微生物尤其是传统遗传操作较难微生物的基因组编辑，例如碱基或大片段的插入、缺失或突变等更为简单、高效和易操作；CRISPR/Cas9以及CRISPRa和CRISPRi技术，在原核和真核微生物基因表达调控、代谢工程等领域具有巨大的应用潜力，如医药、食品以及工业等相关重要产品的获得。未来，结合微生物组学大数据等，继续挖掘不同微生物来源的CRISPR/Cas系统或其他新型基因编辑工具，并对已有CRISPR/Cas9系统继续优化升级，降低脱靶率、提高编辑效率并扩大CRISPR/Cas9的应用范围。关键词 CRISPR/Cas9

6、；真菌；细菌；基因编辑；代谢工程；基因表达调控Application progress of genome editing technology CRISPR/Cas9 in microbial cellsDENG Ming & DING Junmei1*Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy, Ministry of Education, Yunnan Normal University, Kunming 650500, ChinaAbstract CRI

7、SPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins) system is an acquired immune defense system which is widely distributed in prokaryotic organisms and defends the invasions of exogenous genetic materials. Modified from type II CRISPR/Cas system, CRISPR/Ca

8、s9 is the third generation of genome site-specific editing technology after zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENS). Based on recent researches, this paper reviews the discovery, immune defense, and mechanisms of CRISPR/Cas9, and summarizes its appli

9、cations in microbial cells. CRISPR/Cas9 system recognizes PAM sequence and performs cleavage function by a complex composed of tracrRNA, crRNA and Cas9, and the PAM sequences are different in different microorganisms; CRISPR/Cas9 technology is more simple, efficient and easy for the genome editing o

10、f microorganisms, such as base or large fragment insertion, deletion or mutation, especially those that are difficult to manipulate using the traditional genetic operation method; CRISPR/Cas9, CRISPRa and CRISPRi have great application potential in prokaryotic and eukaryotic for the regulation of ge

11、ne expression, metabolic engineering and other fields, such as the acquisition of important products related to medicine, food or industry. In the future, more other CRISPR/Cas systems or new genome editing tools should be continuously explored under the help of big data of microbiomes. Meanwhile, t

12、he existing CRISPR/Cas9 system should be continuously optimized and upgraded to reduce its off-target effects, improve the editing efficiency and expand its application scopes.Keywords CRISPR/Cas9; fungi; bacteria; gene editing; metabolic engineering; gene expression regulation基因编辑（gene editing），又称基

13、因组编辑（genome editing），是研究基因功能的重要手段，一直是现代分子生物学的研究热点。基因编辑工具主要包括：基于人工核酸内切酶的锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats，成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR-associated proteins，CRISPR相关蛋白）系统，三种技术所涉及

14、的核酸酶结构均包含DNA识别结构域和DNA切割结构域 1。然而，由于ZFNs和TALEN技术存在组装时间长、费用较高以及基因编辑效率低等问题，限制了二者的应用范围。CRISPR/Cas系统尤其是CRISPR/Cas9技术，因具有设计和操作简单、成本低、高效准确、通用性广等优势，已成功应用于动植物和微生物的基因组编辑，备受各领域关注1。本文将基于CRISPR/Cas9系统的发现、作用机制，重点概述CRISPR/Cas9基因编辑技术在微生物细胞中的应用，并对该系统在微生物应用中出现的问题及未来应用前景进行讨论。1 CRISPR/Cas系统1.1 CRISPR/Cas系统的发现及分类CRISPR/C

15、as系统分布于40%已测序细菌和90%已测序古菌基因组中 2，是细菌和古菌抵御病毒或质粒的获得性、可遗传的免疫系统。1987年，日本学者Ishino等在研究大肠杆菌（Escherichia coli）中的碱性磷酸酶基因时首次发现CRISPR序列3，由于当时基因组信息的匮乏，对于这种序列存在的生物学意义以及结构和功能的普遍性未知。 直到2002年，荷兰科学家Jansen等通过生物信息学分析，发现CRISPR序列仅存在于细菌和古菌中，在真核生物或病毒中未被发现，并首次提出CRISPR-associated protein的概念4。2005年，西班牙的Mojica5以及法国的Pourcel6和Bol

16、otin7课题组等首次预测CRISPR-Cas的生物学功能可能通过保存病毒（或质粒）的序列信息并获得抵御此类遗传元件再次入侵。该预测于2007年被法国科学家Barrango等通过实验证实：嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）从噬菌体获得新的间隔序列并插入到CRISPR序列中，进而获得对该类噬菌体的抵抗，同时证实Cas蛋白（Cas5，即后续的Cas9蛋白）在抵御过程中的作用8。 2011年，Charpentier团队在酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）中鉴定到了tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA），且证实

17、tracrRNA既帮助crRNA成熟，又是CRISPR/Cas9系统抵抗外源核酸所必需9。随后，Charpentier和Doudna团队合作，于2012年证实：Cas9-crRNA-tracrRNA复合物（即：CRISPR/Cas9系统）可以实现DNA的体外精确切割10。 2013年，张锋团队首次利用CRISPR/Cas9系统实现了对人类细胞的基因组编辑11。自此，作为一种崭新的、简单高效的基因组编辑技术，CRISPR/Cas9被应用于各种动植物、微生物的基因组编辑，并显示出巨大的应用潜力。随着大量细菌或古细菌基因组、宏基因组被测序，越来越多的CRISPR/Cas系统被注释，不同CRISPR/

18、Cas系统在Cas蛋白和CRISPR位点结构组成呈现多样性。2020年，Makarova等根据Cas效应蛋白的组成及CRISPR位点，将被注释到的所有CRISPR/Cas系统分为两大类12。第一类：自然界中分布最广，目前细菌和古细菌（包括所有的超嗜热古菌）中已鉴定的90%的CRISPR/Cas系统属于Class I，包括Type I，Type III和Type IV三种类型，其特点为：由多个Cas蛋白组成效应复合体12-13。第二类：仅需单一Cas蛋白就能在crRNA的引导下发挥免疫功能，仅有10%已被注释的CRISPR/Cas系统属于Class II，包括Type II、Type V和Typ

19、e VI三种类型12-13。目前，第二大类中，Type II-CRISPR/Cas9研究和应用最为深入，在生命科学和医学等领域都获得了极为广泛的应用，本文主要围绕CRISPR/Cas9基因编辑技术在微生物领域中的研究及应用进展进行综述。1.2 CRISPR/Cas9系统的免疫防御CRISPR/Cas9系统包括CRISPR array和Cas基因簇。CRISPR array由重复序列（长度36 bp）和间隔序列（长度26-72 bp）按一定顺序排列组成。前导序列（长度为300-500 bp）富含A、T碱基，位于CRISPR序列的5端，是新的Spacer插入的识别位点，负责CRISPR序列的转录1

20、4。CRISPR/Cas9系统包括Type II-A（如酿脓链球菌S. pyogenes中的CRISPR/Cas9系统）15、Type II-B（如弗朗西斯菌Francisella novicida中的CRISPR/Cas9系统）16和Type II-C（如脑膜炎奈瑟球菌Neisseria meningitidis中的CRISPR/Cas9系统）17三种来源于细菌中的亚型以及2017年Burstein等报道的唯一来源于古菌Micrarchaeum acidiphilum ARMAN-1中的CRISPR/Cas9系统18，效应蛋白均为Cas9。适应（Adaptation）、表达（Expressi

21、on）和干扰（Interference）三个阶段构成了CRISPR/Cas9的免疫防御过程14（图1）。第一阶段-适应：即外源DNA的俘获。外源DNA入侵时，Cas1和Cas2蛋白复合物扫描并识别原间隔序列临近短的、较为保守的基序（Protospacer adjacent motif，PAM）。随后，Cas1/2蛋白复合物将PAM临近的原间隔序列从外源DNA序列中剪切下来并作为新的间隔序列整合到CRISPR array的5端。CRISPR序列整合了新的外源DNA的信息并形成特异性免疫记忆，为获得性免疫提供了结构基础2, 14；第二阶段-表达：即crRNA的合成。已获得特异性免疫记忆的细菌或古菌

22、，当同类外源性DNA片段再次入侵时，CRISPR序列在前导区调控下转录出前体RNA（pre-crRNA）和tracrRNA。在核糖核酸酶III（RNase III）、Cas9及tracrRNA协助下，pre-crRNA被剪切成crRNA（包含单一种类间隔序列的RNA及部分重复序列）14-15；第三阶段-干扰：即靶向切割。crRNA、tracrRNA以及Cas9组成最终复合物，识别与crRNA互补的外源DNA序列，DNA双链被解开（图1）。随后，Cas9核酸酶的两个结构域HNH（作用于与crRNA互补链）和RuvC（作用于非互补链）分别对DNA双链进行切割，造成DNA双链断裂，最终由细胞内的非同

23、源末端连接或同源重组修复途径对DNA损伤进行修复14-15。1.3 不同CRISPR/Cas9工具的作用机制目前应用最为广泛的基因编辑工具是酿脓链球菌S. pyogenes中的CRISPR/Cas9系统，由tracrRNA、crRNA（二者可以嵌合为一条single guide RNA，即sgRNA）以及Cas9蛋白组成复合物行使切割功能。Cas9-RNA复合物识别PAM序列，并对紧邻PAM的上游序列进行切割。S. pyogenes中的PAM序列为5-NGG-3（N为任意核苷酸）9-11。不同物种来源的CRISPR/Cas9系统识别的PAM序列具有差异，如：白喉杆菌（Corynebacteri

24、um diphtheriae）中CRISPR/Cas9系统识别的PAM序列为5-NNRHHHY-3（N为任意核苷酸，R代表A或G，H代表A或T或C，Y代表T或C）19、嗜热链球菌（S. thermophilus）中CRISPR/Cas9系统识别的PAM序列为：5-NNAGAAW-3（N为任意核苷酸，W代表：A或T）20等。CRISPR/Cas9系统可以切割DNA双链，实现对基因组的编辑，同时，改造后的CRISPR/Cas9系统也被用于基因表达调控和代谢工程等领域，如：CRISPRa（CRISPR activation, CRISPR激活）和CRISPRi（CRISPR interference

25、，CRISPR抑制）工具的出现。2013年，Gilbert等将Cas9核酸酶的两个活性结构域RuvC（D10A）和HNH（H840A）中的关键活性位点进行定点突变，突变后的Cas9蛋白不具有核酸内切酶活性，将其命名为dCas9（dead Cas9）。dCas9虽不具有DNA剪切能力，但在sgRNA的引导下仍可精确的与目的DNA序列结合21。当dCas9与其他效应蛋白，如：阻遏蛋白、转录增强子以及表观遗传修饰因子等融合后，dCas9可将这些效应蛋白带到启动子区域、调控区域或编码区域，对任何基因进行精确的转录调控（抑制、增加或表观修饰）而不造成DNA损伤21。例如，当dCas9与转录激活结构域融合

26、时，可以激活特定基因的转录，进而开发出CRISPRa基因编辑工具；当dCas9与阻遏蛋白如KRAB融合时，从而阻止其他蛋白进入或打开特定的基因，降低基因表达，最终减少编码蛋白的表达量，即CRISPRi。CRISPRa和CRISPRi均可在不改变DNA序列的情况下实现对基因表达的精准调控22。CRISPR/Cas9、CRISPRa以及CRISPRi在原核或真核微生物中都得到了广泛应用。迄今，已成功应用于链霉菌属23、大肠杆菌24-26、棒杆菌属27、梭菌属28和链球菌属29等原核微生物30以及酵母31-38、丝状真菌39-43和高等大型真菌44-47等真核微生物中，对微生物中重要功能基因、基因表

27、达调控、代谢工程等研究提供了极为简单、有效的操作工具，极大拓展了其在不同微生物及研究领域的应用。图 1 CRISPR/Cas9系统的适应性免疫：分为适应、表达和干扰3个阶段（根据文献2, 14-15绘制）.Fig. 1 CRISPR/Cas9 adaptive immunity, including adaption, expression and interference 2, 14-152 CRISPR/Cas9系统介导的微生物基因组编辑2.1 CRISPR/Cas9系统介导的原核微生物基因组编辑在复制或内、外源因素的影响下，DNA可能会发生双链断裂（DNA double-strand b

28、reaks, DSBs），造成基因组的不稳定进而导致细胞死亡。DNA修复主要有：同源定向修复（Homology-directed repair, HDR）（需要外源供体DNA作为模板）和非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）（无需模板）两种机制。真核生物主要依赖于HDR和NHEJ两种修复途径响应DNA链的断裂，而原核生物主要依赖于HDR进行修复30，主要原因有：（1）NHEJ途径仅存在分枝杆菌属（Mycobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）以及农杆菌属（Agrobacterium）等极少数细菌中，

29、多数细菌缺少NHEJ修复途径，需依赖于DNA模板介导的HDR途径完成修复，否则DNA双链断裂很容易引起细胞死亡48。因此，当利用CRISPR/Cas9技术对原核微生物基因组进行编辑时，人为提供待编辑基因的同源重组片段，通过HDR途径进行DNA断裂片段的修复，实现基因的缺失、突变或插入30。2013年，Jiang等首次利用S. pyogenes中的CRISPR/Cas9系统实现了对肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）和E. coli中的基因组编辑，且含有目的突变位点的细胞修复率分别达到了100%和65%29。相比较于传统的-Red重组系统，CRISPR/Cas9基因编辑

30、工具具有简便、高效、无需筛选标记以及阳性克隆鉴定简单等优势，能够对微生物基因组中单基因或多基因进行编辑。例如：2015年，中国科学院植物生理生态研究所杨晟课题组通过构建双质粒系统（pCas/pTargetF），将Cas9、-Red系统以及温度敏感型复制子（repA101）构建到pCas质粒，而将sgRNA构建到pTarget质粒中，同时提供DNA修复模板，成功实现了E. coli基因组中基因的插入或缺失，且能同时编辑3个基因，编辑效率达到了100%。此外，此系统对柠檬塔图姆氏菌（Tatumella citrea）的基因编辑效率也达到了100%，T. citrea是维生素C前体2-酮基-D-葡萄

31、糖酸（2-keto-D-gluconic acid）的生产菌，CRISPR/Cas9系统在此菌中的成功应用为后续T. citrea代谢工程的改造奠定了基础49。2021年，杨晟课题组又推出了升级后的pEcCas/pEcgRNA系统，实现了对E. coli BL21(DE3)中目标基因的编辑50；随后，2016年，中科院天津工业生物技术研究所Zhao等通过构建单质粒系统，将Cas9、根据所要靶向基因设计的sgRNA、-Red重组酶（包括exo、Beta和Gam基因）系统以及供体DNA（donor DNA）构建到同一个质粒pRed_Cas9中，成功实现了对E. coli基因组的单基因以及多基因编辑

32、，且对位点的编辑效率达到了100%51。同年，德国学者Altenbuchner Josef将Cas9基因、sgRNA、以及待敲除片段两端各700 bp的供体片段整合为一个质粒（pJOE8999），转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）感受态细胞，实现了基因组中25.1 kb和4.1 kb大片段的敲除52。除在链球菌属29、大肠杆菌属49-51和枯草芽孢杆菌属52中被成功应用外，CRISPR/Cas9也在梭菌属（Clostridium）（例如：Clostridium beijerinckii53和Clostridium acetobutylicum54）、 链霉菌（Strepto

33、myces）属（例如：Streptococcus coelicolor和Streptococcus collinus 23）、 乳酸菌属（Lactobacillus casei55）等微生物中也被成功应用。同时，CRISPR/Cas9以及其他CRISPR/Cas 工具也在很多传统遗传操作较为困难的病原微生物如结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、鼠疫杆菌（Yersinia pestis）以及与环境污染修复和生物合成相关的微生物，如恶臭假单

34、胞菌（Pseudomonas putida）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）等中得到了成功应用30，为病原微生物致病机制的认知、新型抗生素的研发以及环境污染修复等提供了理论基础，为未来与微生物相关领域的研究提供了无限可能。2.2 CRISPR/Cas9系统介导的真核微生物基因组编辑2.2.1 酵母基因组编辑 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为最简单的真核生物和模式生物，在代谢工程、合成生物学、细胞凋亡等研究领域都发挥了极为重要的作用。2013年，DiCarlo等首次报道了

35、CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母中的应用，将带有人工设计的sgRNA的质粒和供体DNA转到含有组成型表达Cas9蛋白的细胞中，无需筛选标记，实现了精氨酸通透酶CAN1基因的编辑且效率达到了100%31；2014年，Ryan等通过将Cas9基因和3个不同的sgRNA表达盒构建到同一质粒中，三个基因在单倍体酵母中的敲除效率达到了100%32；2015年，Laughery等进一步优化了用于S. cerevisiae基因组编辑的质粒（pML104），在含有Cas9基因质粒中的sgRNA表达盒两端加入BclI和SwaI酶切位点，使sgRNA与质粒的连接简单高效，同时，在转化过程中提供与待编辑片段同源

36、重组的模板，在模板中与sgRNA互补配对的位置或PAM序列引入突变，使编辑成功的子细胞不会被Cas9蛋白继续切割，而未被编辑的细胞最终会被后续Cas9切割引起DNA断裂而最终导致死亡，无需筛选标记。为酿酒酵母基因组的快速、高效编辑提供了非常好的思路和流程33。2016年，河北大学Hao等人利用CRISPR/Cas9技术成功实现了S. cerevisiae基因组中大于30 kb片段的敲除，敲除效率（10%）比传统的同源重组方法（0.4%）高 34；2018年，中国科学家覃重军和薛小莉团队利用CRISPR/Cas9技术剪掉了酵母染色体中冗余的重复基因信息，首次实现了将酵母16条天然染色体合成为单条

37、巨大染色体，且酵母仍能够生长和繁殖，为研究有关染色体、细胞衰老以及探索生命起源与进化等重要科学问题提供了较好的实验材料和思路35。此外，CRISPR/Cas9技术也在其他酵母种属如毕赤酵母（Pichia pastoris）36、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）37、致病白色假丝酵母（Candida albicans）38等中得到了成功应用，为以酵母为模式生物在合成生物学、代谢工程等领域的研究提供了更为广阔的空间。2.2.2 丝状真菌基因组编辑 作为真核微生物中的一大类，丝状真菌在自然界中分布广泛，在农业、食品以及医药工业领域均发挥着重要作用。然而，丝状真菌属于多细

38、胞真核微生物，遗传背景较细菌等原核微生物复杂、遗传操作较为困难、遗传转化效率极低且需要合适的筛选标记，极大限制了丝状真菌遗传学和分子生物学相关的研究以及丝状真菌在各领域的应用。因此，丝状真菌简单、快捷、高效率遗传操作体系的建立尤为重要。CRISPR/Cas9基因编辑技术被报道后，在丝状真菌中得到了成功应用。2015年，Liu等利用CRISPR/Cas9基因编辑技术首次实现了里氏木霉（Trichoderma reesei）基因组的编辑，向细胞中转入0.21.0 kb的供体DNA片段，单基因敲除效率达到了93%以上、双基因敲除率达43%以上，胜于传统基因编辑方法39；同年，Arazoe等人利用CR

39、ISPR/Cas9基因编辑系统成功敲除了稻瘟霉菌（Pyricularia oryzae）中的小柱孢酮脱水酶基因（Scytalone dehydratase, SDH）。稻瘟病真菌是一种模式病原真菌，对其分子生物学的研究可以为该类病害防治提供理论基础40；随后，Ndvig等人利用CRISPR/Cas9技术成功实现了构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）和棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）等丝状真菌的单基因以及多基因的基因组编辑41；2016年，Pohl等在产黄青霉（Penicillium chrysogenum）中建

40、立了一种无需筛选标记的CRISPR/Cas9基因编辑工具，成功实现了P. chrysogenum中基因的敲除，为天然化合物的发现和挖掘提供了重要实验材料42。同年，Schuster等利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了玉米黑粉菌（Ustilago maydis）中与玉米致病相关基因的编辑，为研究黑粉菌对玉米的致病性提供了重要的技术条件43。此外，基因编辑技术在大型食药用真菌中也得到了成功应用。例如，2016年，Waltz利用CRISPR/Cas9工具对双胞蘑菇（Agaricus bisporus）基因组中与褐化相关的6个多酚氧化酶基因中的1个基因进行了编辑，其菌株中多酚氧化酶活性下降了

41、30%，获得的突变双孢蘑菇具有抗褐变能力，首次实现了对大型真菌的基因组编辑44。2017年，Sugano等人利用CRISPR/Cas9技术对担子菌门中的灰盖鬼伞菌（Coprinopsis cinerea）进行了基因编辑45。2019年，Vonk等建立了裂褶菌（Schizophyllum commune）的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法，实现了同源域转录因子（homeodomain transcription factor, hom2）基因的敲除46。2020年，上海交通大学钟建江团队利用CRISPR/Cas9技术实现了灵芝（Ganoderma species）的基因组编辑，精准编辑

42、了与灵芝酸生物合成相关的细胞色素P450单加氧酶基因（cyp5150l8），结果显示：当cyp5150l8基因被编辑后，编辑菌株相比野生菌株灵芝酸的产量明显下降47。因此，CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现，对遗传背景复杂以及遗传操作困难的丝状真菌以及大型食药用真菌中功能基因的研究、分子育种、遗传代谢调控、重要代谢产物（如抗生素）的挖掘等研究具有极其重要的意义和价值。3 CRISPR/Cas9系统介导的微生物基因表达调控对目标基因表达的精准调控也是研究基因功能的重要手段。CRISPR/Cas9系统除应用于微生物基因组编辑外，也被成功应用于微生物中的基因表达调控。由CRISPR/Cas9衍

43、生的CRISPRi和CRISPRa工具由于在行使功能的时候未对DNA产生切割，因此，不涉及DNA的修复。2013年，Qi等人首次将CRISPRi（dCas9-sgRNA）应用于E. coli中基因的表达调控，目的基因的表达降低了1000倍且未出现任何脱靶效应，并将CRISPRi成功应用到了哺乳动物细胞中的基因表达调控56；2017年，Lian等利用酵母内源的抑制蛋白如RD2、RD5和RD11构建基因抑制表达框dSpCas9-RD2、dSpCas9-RD5、dSpCas9-RD11，对番茄红素代谢通路中的麦角固醇基因（ERG9）和高尔基甘露糖基转移酶复合物亚基基因（MNN9）成功实现了抑制，提高

44、了番茄红素的产量以及外源蛋白的分泌57；2019年，Peters等利用Mobile-CRISPRi靶向致病菌中可能的抗药基因，进而改变和开发新型抗生素，解决致病菌的耐药性问题58。同时，CRISPR/Cas9技术还被应用于降低病原微生物的毒力，例如：通过抑制新凶手弗朗西斯菌（F. novicida）内源性的与免疫激活相关的脂蛋白基因的表达抑制其致病毒力59。此外，CRISPRi也被成功用于蓝藻（Synechococcus elongates PCC7942）和放线菌（Actinomycetes）中60。当dCas9与转录激活结构域融合时，可以激活特定基因的转录表达（CRISPRa）。例如，Li

45、an等将dCas9与转录激活结构域VP64-p65-Rta（VPR）连接，成功实现了酿酒酵母中基因表达的激活57；2018年，Hu等利用噬菌体协助连续进化策略（Phage-assisted continuous evolution, PACE）对SpyCas9进行改造，获得SpyCas9的突变体xCas9，将dxCas9与转录激活结构域VP64-p65-Rta（VPR）连接构建dxCas9-VPR，利用绿色荧光蛋白GFP为报告基因，成功获得了目标基因的转录激活61；2018年，Peng等利用CRISPR/dCas9系统，成功实现了黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）中与埃博霉素合

46、成相关的基因的转录激活，提升了埃博霉素的产量62。同年，Dong等利用筛选得到的转录激活结构域SoxS与CRISPR/Cas9的DNA-binding结构域结合获得CRISPRa，实现了E. coli中基因的转录激活，且实现了对外源乙醇合成途径的调控63。鉴于CRISPRi以及CRISPRa转录抑制和激活工具设计简单且操作便捷，未来将是对动物、植物和微生物等物种中基因表达调控的主要手段。4 CRISPR/Cas9系统介导的代谢工程4.1 原核微生物细胞中的代谢工程CRISPR/Cas9出现后，利用该工具构建的原核微生物细胞工厂，成功实现了多种食品、化工以及药品等产品的代谢工程的生产。1, 4丁

47、二醇（1, 4-butanediol, 1, 4-BDO）是一种重要的有机化工和精细化工原料，其不能通过微生物自然代谢产生，主要通过化石原料获得，广泛用于聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）工程塑料、氨纶、制药及化妆品等领域。2017年，Wu等利用CRISPR/Cas9以及CRISPRi，在E. coli基因组中插入了1, 4-BDO合成途径，成功实现了1, 4-BDO在微生物中的代谢生产。利用CRISPR/Cas9对柠檬酸合酶（Citrate synthase, gltA）基因进行突变，并将E. coli中内源的丙酮酸脱氢酶lpdA基因替换为异源的来自肺炎克雷伯菌中的lpdA基因，敲除琥珀酸半醛脱

48、氢酶sad基因以及在E. coli基因组中敲入6.0 kb和6.3 kb长度、编码1, 4-BDO合成途径中的6个关键基因（cat1, sucD, 4hbd, cat2, bld, bdh）。同时，利用CRISPRi，抑制1, 4-BDO代谢途径中-丁内酯和琥珀酸副产物的生成，最终在E. coli中重塑了1, 4-BDO的合成途径，使1, 4-BDO的产量达1.8 g/L，极大降低了化学制品的生产成本24,64；同年，Zhu等构建三质粒CRISPR/Cas9系统，优化大肠杆菌E. coli中与木糖利用相关的调控序列，在随机挑选的200个突变子中73%菌株三位点同时被编辑，且最优菌株对木糖的利用

49、效率比野生菌株提高了3倍，为高效利用木质纤维素生产化学品的细胞工厂的构建奠定了较好的基础25,64；异戊二烯是聚异戊二烯橡胶的重要单体，主要通过化学方法由石油基原料获得，成本高、环境污染严重且产物收率低。因此，可持续的异戊二烯生产方式是其工业生产的重要手段。2018年，Alonso-Gutierrez等利用CRISPR/Cas9技术在E. coli基因组中整合可以利用蔗糖的cscAKB操纵子，同时异源表达与异戊二烯合成相关的重要前体物质产生的甲羟戊酸（MVA）代谢途径，获得的E. coli DH1重组菌株既可以发酵利用蔗糖，又实现了异戊二烯（甜没药烯）的生产，大大降低了异戊二烯的生产成本及对环

50、境的污染26；利用CRISPR/Cas9技术对梭菌属来源的微生物，如Clostridium autoethanogenum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium pasteurianum等菌株中与产物生成相关代谢网络的改造和调节，或通过引入相应的代谢途径，获得能利用CO、CO2、H2、木质纤维素或废弃甘油等原料发酵产生一系列生物燃料，如乙醇、2, 3-丁二醇、正丁醇等的菌株，同时提高了目标产物的获得率28；除此之外，蓝细菌也是乙醇、丙醇、丁醇、烯烃、

51、烷烃以及脂肪酸等许多重要化工产品的合成底盘，被称为“光合细胞工厂”。由于蓝藻为二倍体或多倍体微生物，其遗传操作较为耗时，而CRISPR/Cas9技术极大缩短了蓝藻基因编辑的过程。结合CRISPR/Cas9以及CRISPRi等技术，微调代谢途径并减少细胞对不需要的副产物的通量，在不会严重影响细胞活力的同时提高了目标化学品的产量65。表1对CRISPR/Cas9技术在部分原核微生物代谢工程中的应用进行了总结。值得关注的是，CRISPR/Cas9以及其他CRISPR/Cas系统在对传统遗传操作较为困难的微生物进行代谢工程改造呈现出巨大优势。如，耻垢分枝杆菌mc2155（Mycobacterium s

52、megmatis mc2155）是甾体药物中间体生产常用的细胞工厂，但存在目标产物得率较低等问题。2020年，中国科学院天津工业生物技术研究所马延和团队利用CRISPR/Cas12a对影响重要的甾体药物中间体9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮（9-OH-AD）积累的3个编码3-甾酮-1-脱氢酶的基因（KstD1、KstD2、KstD3）成功实现了敲除，获得了能够稳定积累9-OH-AD的菌株，为甾体类药物中间体的生物转化提供了非常好的实验菌株和思路66。4.2 真核微生物细胞中的代谢工程 通过代谢工程的手段，优化设计酿酒酵母的物质和能量流动，是提高目的产物产量和效率的重要手段。2015年，Ja

53、kociunas等将5个sgRNA串联构建到载体上，实现了S. cerevisiae中5个与甲羟戊酸代谢抑制相关的基因的100%同时敲除，使酵母中甲羟戊酸的积累提高了41倍67；除利用基因敲除调控代谢网络外，CRISPR/Cas9技术还被应用于酵母中基因的敲入进而调控代谢流控。2016年，Shi等人利用CRISPR/Cas9技术在酵母基因组中插入了18个拷贝、24 kb、与木糖利用途径和(R,R)-2,3-butanediol (BDO)丁二醇生物合成途径中的相关基因，获得的改造后酵母菌株能够直接利用木糖产生丁二醇68。同年，EauClaire等人利用CRISPR/Cas9在酵母基因组中插入了

54、17个片段，构建了一条完整的-胡萝卜素的生物合成途径69；2017年，Lian等利用CRISPRa上调酿酒酵母中甲羟戊酸途径中的限速酶基因HMG1，利用CRISPRi对-胡萝卜素和甾醇生物合成分支途径中的基因ERG9进行抑制，并对转录调控因子ROX1基因进行敲除，最终获得的酿酒酵母菌株产-胡萝卜素的能力提高了3倍57；此外，利用CRISPR/dCas9转录激活调控工具可以实现对酿酒酵母代谢通路中多种关键酶基因的表达调控，提高目的产物的产量。例如，Jensen等利用dCas9-VPR靶向三酰基甘油（triacylglycerols, TAGs）生物合成途径中的关键基因：编码deta-9-去饱和酶

55、基因OLE1和二酰甘油酯酰基转移酶DGA1基因的启动子区域，最终使目标产物三酰基甘油的产量提高了2倍以上70。Ferreira等利用dCas9-VPR介导的转录调控工具以及靶向酵母168个基因的gRNA文库，结合基于转录因子FapR的丙二酰辅酶A细胞内生物传感器，利用细胞分型和文库测序，筛选促进代谢流向丙二酰辅酶A的靶基因和gRNA，获得的突变子的3-羟基丙酸的产量显著提高71； 2019年，Ni等利用CRISPRi下调酿酒酵母中能够竞争产-香树脂醇的前体物质的7个相关基因， 7个基因的转录抑制率均达到了75.5%，获得的酵母突变子产-香树脂醇的量达到了156.7 mg/L72。综上所述，CR

56、ISPR/Cas9、CRISPRa以及CRISPRi基因编辑和转录调控工具的结合应用，在微生物代谢通路改造、代谢靶点筛选以及代谢机制解析等方面均发挥着重要作用。随着CRISPR/Cas9工具不断优化以及新的CRISPR/Cas系统基因编辑工具箱的不断丰富，其在微生物细胞工厂以及其他研究领域将会有更加广泛的应用。表1对CRISPR/Cas9技术在部分真核微生物代谢工程中的应用进行了总结。表1 CRISPR/Cas9系统介导的原核和真核微生物细胞的代谢工程Table 1 CRISPR/Cas9-based metabolic engineering in prokaryotic and eukar

57、yotic cells菌种Strain应用Application参考文献Reference原核微生物 Prokaryotes大肠杆菌 Escherichia coli大肠杆菌 Escherichia coli利用CRISPR/Cas9和CRISPRi，对大肠杆菌基因组和代谢流编辑和调控，实现了1,4 丁二醇的生产Combined with CRISPR/Cas9 and CRISPRi for E. coli genome engineering and metabolic flux regulation for production of 1,4-butanediol (1,4-BDO)优化

58、大肠杆菌染色体上与木糖利用相关的基因，改造菌株实现了对木糖利用效率3倍提升Optimization multiple genes on the chromosome of E. coli, and xylose-utilization rate of the engineered strain increased 3-fold2425大肠杆菌 Escherichia coli梭菌属 Clostridium蓝细菌Cyanobacteria大肠杆菌基因组中整合可以利用蔗糖的操纵子，同时表达甲羟戊酸代谢途径，实现异戊二烯的生产Integration of sucrose utilized opero

59、n into chromosome of E. coli and expression a heterologous mevalonate pathway for production of isoprenoid bisabolene代谢产生物燃料，如：乙醇、正丁醇等Production of biofuels, for example ethanol and butanol基因组的高效利编辑及调控，如琥珀酸的获得High-efficiency genome editing and regulation, for example, production of succinate262865真核

60、微生物 Eukaryotes酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae酵母基因组编辑，使甲羟戊酸产量提高了41倍Genome engineering of S. cerevisiae, and the mevalonate production increased 41-fold compared to the wild type strain67酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因组中整合木糖利用和丁二醇生成途径，获得的菌株能够直接利用木糖产丁二醇Integration of combined xylose utilization and (R,R)-2