菌种选育保存和复苏001

1、 菌种选育保存和复苏001第一节 菌种的分离一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物

2、筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。 二、分离思路 （一）成功的分离培养方法(1)认真考虑所需产品的特征和生产过程；(2)制订初步的筛选标准；(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。（二）培养分离中要解决的问题1、“分离什么和从哪里分离出?” 2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生 长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其 提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定 性及遗传操作的难易程度等。3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。（三）将生态学方法用于培养分离的一般思路要点1、罗列出所要分离的微生物类群

3、；2、根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分 离的微生物之生态系统或栖息地：3、将若干样本分成若干类型，如植物和植物各 部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发 酵食品等；4、罗列出所要考察和测量的环境参数，如pH、盐 分、水分、氧化还原电势及温度等；5、列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤 中的几丁质、葡萄表皮的果胶；6、根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方 法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然 浸出汁和培养条件；7、用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8、根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9、运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选 意义的微生物类群。定方案：

4、首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤 （一）采样1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选2、采样季节：

5、 以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式： 在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地 面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或 塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、 环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的 数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回， 以便及时分离。（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种

6、分离就会顺利得多。 厌氧或好氧、酸碱度的选择、特殊的生理特性、添加特殊的抑制剂（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。（四）筛 选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作

7、为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 (一)采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。四、实例自然界中细菌的分离采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集 日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处

8、理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。1土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。2植物体采集方法在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安

9、全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。 3水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测

10、，或者4下贮存。(二)生态学参数及培养基的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50gm1， 以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。（三）土中细菌的富集培养与

11、分离 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。富集方法运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。富集可以促进抗性的产生并维持下来。土样中细菌的富集：适度稀释后，取涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。水中细菌的分离：水样通过无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸

12、压印分离法。水中细菌分离的简易富集技术在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上

13、。筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。生产选种 在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。第二节 工业菌种的育种方针工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除

14、不良性质或增加新的性状。工业菌种育种的方法诱变基因转移基因重组育种过程包括下列3个步骤： (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的 引入。 (2)希望基因型的选出。 (3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产 规模)。选择育种方法时综合考虑的因素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式 或连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的 明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。工业菌种改良方法(1)解除或绕过代谢途径中

15、的限速步骤：通过增加 特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力 来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出 新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品 的结构类似物抗性。 提高特定基因的表达水平引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。诱导解除基因表达抑制的突变。 改进菌种的生长效率通过确定并改变

16、代谢中的耗能部分;由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用。提高菌株对底物的利用率方法：第三节 营养缺陷型的选育营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。与营养缺陷型对应的是野生型。一、基本概念能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。二、营养缺陷型的用途 营养缺陷型在生产

17、上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。三、筛选营养缺陷型的步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱(一)出发菌株的选择1、自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较 敏感，容易达到好的效果。2、在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较 相像，也是良好的出发菌株。3、每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多 次诱变能积累较多的提高。4、出发菌株开始时可以同时选23株，在处理 比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。 5、要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细 胞体来作出发诱变细胞，这是由于

18、变异性状 大部分是隐性的，特别是高产基因。 6、根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱 变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处 理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有 的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期 的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。 (二)处理菌悬液的制备 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。（三）诱变方法物理诱变化学诱变 根据有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。（四）淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活

19、化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。 （五）检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。 具体方法：影印法、点种法、夹层法 1、将一较平且直径小于1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌 的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2、将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻 一

20、压，使之成为印模，标记方位。3、将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的 同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。 1、影印法4、将CM和MM在恒温箱中培养。5、二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平 皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长 而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺 陷型。 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。 2、点种法也就是任意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。 3、夹层法先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄

21、层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。四、营养缺陷型生长谱的确定 验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷因子，即生长谱测定。生长谱测定的方法 将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的56个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。个平皿测一个菌。 以不同组合的营养混合物与融化凉至50的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些

22、平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在56个平皿上可测20株菌以上。第四节 基因育种 1、基因重组育种： 运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。2、一个完整的基因克隆过程包括以下步骤、获得待克隆的DNA片段（基因）；、目的基因与载体在体外连接；、重组DNA分子导入宿主细胞；、筛选、鉴定阳性重组子；、重组子的扩增与或表达。基因重组载体宿主系统 载体(

23、vector)： 是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA；一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。载体应具备以下条件：、能在适当的宿主细胞中复制；、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆 位点）以便外源DNA插入；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载 体DNA与宿主DNA便于分离；、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应 的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元 件。宿主细胞必须符合以下条件、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；、在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；、重组缺陷型，不会产生体内重组

24、；、容易导入重组DNA分子；、符合重组DNA操作的安全标准。第五节 杂交育种 一、细菌杂交在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。F因子存在于细胞中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)。F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。二、酵母杂交育种技术 1、酵母繁殖方式 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍

25、体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。单倍体细胞具及2两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。 2、酵母杂交 一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。 酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。第六节 原生质体育种原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转

26、化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。 一、原生质体融合育种的特点1、杂交频率较高： 细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形 的原生质体。2、受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任 何一株都可能起受体或供体的作用，因此有 利于不同种属间微生物的杂交。3、遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二 亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一 的过程。4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合 子的可能性。5、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。6、提高菌株产量的潜力较大

27、。7、有助于建立工业微生物转化体系。二、原生质体融合育种步骤1、标记菌株的筛选和稳定性验证。2、原生质体制备。3、等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4、涂布于再生培养基，再生出菌落。5、选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取 融合子进一步试验、保藏。6、生产性能筛选。 三、原生质体融合育种的要点 1、标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。2、原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁

28、分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。 四、影响原生质体制备的因素1、菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。2、菌体的培养时间 为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。3、酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。4、酶处理温度 5、破壁时的pH值6、渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶

29、和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。第七节 工业微生物菌种保藏技术 在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特 别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生 产的高产能力。(3) 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。二、工业微生物菌种保藏技术1、冷冻干燥或真空干燥保藏；2、超低温或在液氮中冷冻保藏； 3、转接培养或斜面传代保藏；4、土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。

30、一、冷冻保藏 冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类 一、普通冷冻保藏技术(-20)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80)三、液氮冷冻保藏技术 普通冷冻保藏技术(-20)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面

31、上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。超低温冷冻保藏技术(-60一-80) 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低 温冰箱中保藏。 如果待保藏菌种生

32、长在斜面上，则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。液氮冷冻保藏技术 (一)冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 (二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1、待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)从生长斜面制备菌悬液： 每一斜面加入5ml含10甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶， (2)从浸没培养物制备菌悬液：

33、 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。 2、控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于 一较大的金属容器中； (2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中； (3)以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到 相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为- 30)； (4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点 时尽可能快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1/min，直到 温度达-50；(

34、6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96)或 气相(-156)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。(三)复苏 1、从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中。 2、迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动 以加速解； 3、用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有 2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管 反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (约4、8滴) 转接入琼脂斜面上。二、 冻干保藏 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥

35、过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。培养物的冻干过程(二)操作步骤1启动冷冻干燥器的致冷单元。当冷凝器的温度达到-40时启动真空泵，使真空度达到。2将冷冻槽置于歧管之下方。槽中装入23体积的异丙醇，然后插入温度计及可调温控仪降温探头打开降温探头控制醇浴温度在-40，这过程约需30min。3每支斜面加入2ml 20的脱脂乳，然后用巴氏吸管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液，最终菌株浓度一般要求在106CFUm1用细菌浸没培养物来保藏时，加入40

36、的脱脂乳，混合制成含106CFUml的均悬液。4取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分装安瓿瓿)，重新塞好棉塞。5轻轻振荡安瓿，以使细胞重新悬浮。将安瓿与歧管相联后迅速置于醇浴中，然后调节温控装置。使细胞悬液迅速冻结。615min后，将歧管与真空泵相通。7维持-40的醇浴温度90-120min，然后调节温控装置。使醇浴温度上升至-10，维持2h。8关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上升至室温(25)9在冷冻干燥的最初4h内应定期测真空度，在安瓿置于真空下后1h内，真空度必须达到，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到。10 在真空状态下，让安瓿保存在冷冻干燥机 中至少16h以获得完全干燥。11干燥后

37、，在的真空度下封瓶12在所有安瓿都封盖好后，撤去真空。13关闭真空泵。14关闭冷凝器。三、冻干菌种的保藏与再生1、保藏： 冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培养物的长期稳定更好。2、复苏：(1)在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然 后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰 开安瓿(3)在安瓿中加入1ml营养液体培养基，慢慢 旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到 一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种 琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此 直接振落入盛有l2ml液体培养基的试管中， 轻轻振荡5l0min，然后用此悬液接种适宜的 再生培养基。四、其他保藏方法一、传代保藏 二、矿物油中浸没保藏 一、传代保藏将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5保