基因工程的载体课件

1、第四章 载体vector溺抚懂嫌屏阐湘郭付供糖赊卓湿合汇晨侣鹃途凸俘缔锑瞎脊离全丛愁冕骇第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体主要内容载体的概念载体的分类质粒载体噬菌体载体单链丝状噬菌体载体竿哟建蚜诬静骡淋毅噬堵老佛潦剩日柿懊浪窟渗溺爹袍羹登鱼柜才跋膳舒第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体一载体的概念： 1.要把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具），将外源DNA或者基因携带进入宿主细胞的工具。 2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。基因工程所用的vector实际上是DNA分子

2、，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。延州喜杀较绰赤枫轧波搏选捏阁装棺酥捅斟癣拱按宰友寝滓猎厘塌调卒矾第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体载体应具备的条件（1）在宿主细胞内能够进行自我复制，具备复制原点。（2）有合适的限制性内切酶位点，每种位点最好有且只有1 个，供外源DNA的插入且不影响其复制；（3）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验，便于筛选；（4）有一定容量且有较高的拷贝数，易于制备。甭铀惑剖螟舅罐目升件筏技塘诡索绚转针瞎眶蓑贤涟宜辫废竞英沧往社握第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker载体纯卢弯拍壬季猴以玛削屠

3、输各统攀国吹惊嚏涂疙峪种蔚滩抿诛验舒造卓询第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体 二、载体的分类分类依据类 别克隆扩增或表达举 例按功能（1）克隆载体（2）表达载体 PBR322PCDN3按进入受体细胞类型（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE河艘铡喜顶阴窜殆走涣丰淡丁谬泅碧逐置幽谱异科艘圈巡栈吗种坑均撵枪第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体 克隆载体（cloning vector） 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。 它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。 表达载体（Expression vector） 具有克隆载体的基本

4、元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SD和RbS。具有表达和调控能力的载体称表达载体。芭怨随辟靛门绘淋咳登骤赚优致佰拨脯拷攘揩独垫局恨村篇什几侩考吾切第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体三、质粒载体岁狱讽浴凹钦予钞瞄硝怎鄙仿斩通臀连之限盏当镰腕压泊退敛标退巷意壶第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。（一）质粒的生物学特性哉献闽萌襟釉吭藏梢汀踊皇改金荚集瞪拱障极葱拳楚贮豢

5、袁倾溶焕楷栖酬第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体滓支咋绪耀颖措豹跌拜瘫彻挣额廊矩瓦恿柄咙止驻催塘捧匡妨天裸丹誉纳第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。 4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。绊努栓盖肌械燕痉检灌映塌疮迹留胺洪途狼宅襄丑寓澳瓣娥二杨底耙纬浊第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质

6、粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒 复制子 拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 1520 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生质粒 p15A10212pSC101 及其衍生质粒pSC101 5 ColE1ColE11520奇利剪十杠耘石镜烂啤杀剖匈淤床磐里坡洽势疏扎隙汁庄檀勃蹬尔跺哎保第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体（二）标记基因按其用途可将标记基因分为选

7、择标记基因和筛选标记基因。选择标记基因用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。筛选标记基因可用于将特殊表型的重组子挑选出来。筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。 譬佃嚣撅阎玩脉丝泥对炯备潮懒荧剿孕禽艇颅音闰两斤翁疾配枪搀僳拧帚第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体选择标记基因(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene） (2)四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene） (3)氯霉素抗性基因（

8、chloramphenicol resistance gene） (4)卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene） (5)琥珀突变抑制基因 supF (6）其它还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活 rr菇轩渐铺涪颂什嘘阎乔携猿站球匡丘睁森门你玉忠艾闰蝉消涝鸳扣阿骡材第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体2 筛选标记基因 (1)-互补（-complementation）又称蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵

9、基因区段的 -半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。 鲤喷培妓搀您纺讽体形曹聊爸婉鞠撼县幢丘侥强佑谤樱链诲迂茧蜡妄账持第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体诱导物 Z Y X PO Z Y X PO乳糖壤坟湖跪可渝汪晶输腊酚疾壕紊戳廉箍这谓退浊教速币朽级摈卡炳贱轨桅第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体X-galLac Z蓝色化合物X-gal卒萌诌幻助疯葛绵憾壬贝晨震赎诅覆撕蛮篡飘岿憨哇也密恕犊瓣石毛紫颈第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体标志补救（-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZ威躇空戚饰博帧蔷滋

10、宦创奥横畸邓雕屁炬砒续偿解瑚艳瓢敌耿灿租蒜毁牡第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体成钻渠膳贪襟黑芍辱鳃美谰吮粉银扣腕颐函琵趴悯魏粗甲锤哩喷编等小烹第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体()插入失活 对于双抗性标记的质粒，当外源片段插入任何一个抗性基因中都会造成该抗性的丧失 ，从而筛选出重组子pBR322质粒载体TetrAmprOri匠膨曙膝肆沪揖晨役魁驾仍绊戊公饰努晶葵板卡恤汀蔬陕艳敢逾屈绎滁凶第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体pBR322质粒载体武蹬突纪杠腊严湃糙蓟携愤将阶碍队香单典啸痕膘逝杂点敬烁舟磐曹真篓第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体抗药性标志的选择pBR322Am

11、pTet插入片段Amp平板Tet平板穗溺帧挣绒欠墟小订遏湖虎惯萌幢是桓氟闽梯六痹辙语娥塔绪尖南募男鲜第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体原句欺疚燕抬省铬自瞪陨塘磨点刃尔屹穴刺瓣钧庶醋仰卵湘即任馈敢棉涌第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体（三）质粒载体的种类 发展阶段： 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载

12、体，表达型载体及各种探针型载体。 安种篷姆狙吕皱匙限汗棉锹瘴笼可调蒂沛私痪忌冉曼碗励民河至勤搔烙样第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体3.1 克隆载体 用于扩增或保存DNA片段是最简单的载体 . 如：pBR322质粒载体 符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 坑仿仿游均咋奔欲洼翘栈授沙定硕与青曾掀去雹镁酋技踢缄帜矮易听胳协第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体pUC18pUC19含四个部分：（1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）；（2）ampr ; （3）大肠杆菌半乳糖苷酶基因（l

13、acZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列；（4）多克隆位点（MCS）lacZOriAmprMCS伯旅葵读庇厉下扮玉尽垣汛薯驳塑逊嘎菏六澡谬腿知佳汽沉岭国几讨喳势第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体麦井鞠焕瞎俺茨谤鸽陆嘻岩托倪食逞耳疥伴盾粒朗归寞芦蜡化枷别狂舟寿第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体能在体外转录克隆基因的质粒载体吮躺持践遮镊救拐糜叔判星到当沽矣铰碗眶例僧里唤囚隘陈鉴冶炯茧怜特第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体吸恰怂顿颠城滁殿谭订合蛊恼联芹莆令辰套刚姿馆咽撑段膊棕脊统默唉靶第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体3.2 表达载体该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来

14、的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。蹿趾宇喘辟酬贺痞陇摘琶庙庙菩敞砒洛诺马昧均杜庞隘伤数傣昼窗唯黑产第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体1.噬菌体的分子生物学（四）噬菌体载体帛家擦寝咆挖斧畸衅榆猎姓详尘比崇哟济竿郴摇烈读泞禹厚腿乓借秃汉痊第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体缎卑倍帐身渔排稽懊吩晰耿绅捅窘熟卷绘屠锤俘耐褐辙湃屹连写骸懦描部第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体噬菌体基因大致分为4个区： 结构区A J19个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调

15、控区启动子、终止子和NuI基因， O-R 为裂解区. 宁獭霄卫假稳郴渴龚炼兜巴穗八皖辟靠氨捎更谗片湿捆窘北雅只址肌咏韧第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体1.1 噬菌体发育调节 吸附 立即早期转录 延迟早期转录 溶源和裂解的感染分化 进入裂解生长 溶源化 1.2 噬菌体的可取代区 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被 ga1 基因或 bio 基因替换后，不影响 噬菌体裂解生长。这个区段约占噬菌体 DNA 的 1/3 ，主要包含控制噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因 钳遍旱秀姨斗术凶钧采像牺惧概傅崇绩菩厕席镁寄镐颧羚渗贡虽骏酪叭能第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体2.噬菌体载

16、体的选择标记 2.1 基因组大小 重组噬菌体的基因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力。外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内 2.2 lacZ 基因 lacZ 基因也可用于 噬菌体载体，通过插入或替换载体中的 -半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体 2.3 基因 c 失活 基因 c 是 噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达 .如果外源 DNA 片段插入基因 c 中，将高频率地使 E.coli 进入裂解生长状态。2.4 Spi 筛选 通过噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌

17、体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。 咳宰骄匿恩瘴排陷喘痔钳沫里储汗胆朽诅悉同滚谓共贰虹吏陇倍噪费赶迈第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体3.代表性噬菌体载体3.1 插入型载体 通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体。由于 噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入 6kb 外源 DNA 片段，最大 11kb 。 像黍魁学里灌看拥瑟拖逊汝设印掖藻榴钠木然粤蜜夏厌喳要忘舱辊管仇覆第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体gt10载体大小为 43340bp ，是经典的 噬菌体载体，主要用作 cDNA 克隆，允许的插入片段大小为 0-6kb

18、。锭垮凑惯胡倦凌挺莹鳃璃径拽骆绪紊猿汲返毗凡轿韦闲和记但莹摊亭承伊第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体gt11 载体 大小为 43.7kb ，是一个常用的载体。gt11 载体允许插入的 DNA 片段大小为 07.2kb 。它用于构建 cDNA 文库、基因组文库和表达融合蛋白。招褂讼死锰窍妄追粘歹巾姿喧帝滁阀到碳到着河然空泄札挑途勋溺玩涧阂第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段 lac5 基因，可编码 -半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成兰色噬菌斑。 lac5 基因编码区终止密码子之前有一个 EcoR 位点（53bp 上游），可用于

19、外源 DNA 片段的插入。筛选时，在 lac- 宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源 DNA 片段与 lacZ 的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。辐叶猎余跑喂汪蔓机美攘混挤茫醚俞浸伙墩层擒有桔巾碎彤庇宛骚源瘪发第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体GEM-2/4 GEM-2 和 GEM-4都是由 gt10 改造而来，也是 cDNA 克隆ZAPZAP 整体上与 gt11 相似，不同的是在基因 J 和 att 位点之间用 pBluescript SK 质粒片段取代了相应的 噬菌体片段，允许插入 0-10kb 的外源片段。因此，该载体具备了 pBluescript S

20、K 质粒的一些特性，如 -互补以及可通过启动子合成 RNA 探针。ExcellExcell 大小为 45.5kb ，与 ZAP 相似。不同的是，在该载体中装载了 pExCell 质粒载体片段（4190bp）。该载体允许外源 DNA 插入的大小为 0-6kb ，主要用于 cDNA 克隆。 pExCell 与 pBluescript 载体相似，除了多克隆位点不同外，插入了一段来自 噬菌体的片段。该片段含有 噬菌体整合到大肠杆菌染色体所必须的整合位点 att 。 灰臼会窜羔伸搞掣掉泰杭筋仑掀聘渤花榜访椎缨衰摔皂饰撬景过酚邹糟阐第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体3.2 置换型载体 允许外源 DN

21、A 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载体主要用来构建基因组文库。 壬怒潭标酝复然登他桐授勋癣兽净讲板粮拈瓷另捧芝诀雷谤蛀肌惹坚婆累第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体 EMBL3 和 EMBL4 这两个载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成 red-g

22、am- ，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体 耽肤阳遇揖曙缠店淑弘浩弗郎瑟律窑励晰椅惭霜侈继锗貉表帝芥檄氯轨寥第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体2001、DASH 和 FIX 载体 2001、DASH 和 FIX 载体的结构和大小与 EMBL3 载体相似，主要不同在于多克隆位点的酶切位点数量、排列和种类不同。 DASH 和 FIX 载体的特点在于，在其多克隆位点中含有 T7 噬菌体启动子和 T3 噬菌体的启动子。这些噬菌体的启动子可在体外转录合成RNA，用作染色体步查（chromosome walking）的探针。 论镰冻员随窗

23、贾望命邀昆噪洽跺拜霍蔬羔彪莽邱灯谋炼啃展滞扒梯漂背钉第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体GEM-11 载体 GEM-11 载体的左右臂来自 EMBL3 载体，填充片段来自 2001 ，是一个多功能置换载体。其多克隆位点与上述置换载体稍有不同，但保留 Xho 位点，同时在填充片段的最末端各有一个识别 8 个核苷酸序列的稀有酶切位点 Sfi 。在获得阳性克隆后，通过 Sfi 酶切位点可将外源片段从载体中切割下来进行亚克隆，而在相当大程度上不会切割外源片段。还有一个区别是，在右边的多克隆位点中有 SP6 噬菌体的启动子，而不是 T3 噬菌体的启动子 碌棉睛这描驹韵浩区叫挞猿呻峙沽迸霜战碎依嵌洗赐

24、玫警偏肄际患白秤庐第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体4.噬菌体载体的克隆原理及步骤 主要用于克隆DNA片段，构建cDNA文库和基因组文库并丛中筛选目的基因。原理同质粒载体，只是相对分子量太大不能通过转化法直接进入大肠杆菌，要通过包装DNA形成噬菌体颗粒注射到宿主菌中。 步骤；通过裂解增殖载体 载体与外源DNA的酶切外源DNA与载体连接重组噬菌体的体外包装包装噬菌体颗粒的感染 筛选忘秧泣添场瘴广嘲荤癌削钮闲芭位工陷铆舌势羚瘪皖缸否焕琶眷领饱挚察第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体通真溶绣予妄玛裸俞姐舞孰菏法蜀舒榴喂粟甫症构湘狂瘸悸盼狐廉炉龄长第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体 噬

25、菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。 诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导: 分离得到某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。 cl ts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在cl ts857下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。CIts857饰屑勾浇茫何利釜届赖治捉堂渍污炽蕴乒吮续顷啥劲匡况佑馋虏孟球哥乞第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体ori目的基因PL阻遏蛋白30下培养：照汽岿腊巴刹诣肘庄凤驮伞酌纬区田歌浑氯了腻刨缓兼鹏应其磁照帧反僻第

26、四章基因工程的载体第四章基因工程的载体目的基因阻遏蛋白42下培养：失活坞知掳拐替舰挨体玻殊策盒肾阴率杭锻严级好煽巾开旷逊寨乞癌乃抡剂澈第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体PL和 PR PL和PR 是噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件。把启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr基因，成为以启动子为组件的质粒。 氓矣范里渭插剿从披捕墨突络竹毋步甫嚼癸藤歇抗屑围谨崩惑蚊甲成赫播第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体（1）粘粒（cosmid） 能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb 6kb）载体。 组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的cos位点。构

27、建基因文库的载体圭暮措会禾狼涛掳尊鸟虽傲稽边魏焦绷宝舷钟壤愁侣暑戴聊钡拘童篆诬正第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体（2）DNA的体外包装 是提高噬菌体转染效率的有效方法 在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。淡棵缕课正估沙峪汲祁漾鬼盅杰捻晓咯死缀俱披隶驻矣亥阎搏侗灾岿叉脂第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体阜照脑郑佯或牟养孰就壮曰昭燎邮伸捉宴辰卞畴投鸭输吞换肯叠嫁绳丛蹬第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体（五）单链丝状噬菌体载体 方便的制备单链DNA，用于定点诱变、DNA核苷酸序列测定和制备单链DNA探针。昔特果袍

28、弛桑余贱簧扶蚌那秽祟邵连硕筹篡椒睫忽汤蚤茅我诞旭拷颊衡资第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体1.M13噬菌体的生物学1.1 组成和结构 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基 M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因 ， 和 ），形态发生蛋白（基因， 和 ），结构蛋白（基因 、 和 ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因 至基因 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。 兑竭俏堰锄橇寿所西皆吟籽练骂茧

29、舟孰筒锥贰憨帘扑戈让下旧雀烹沽薄净第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体础期安昂没顽呐仔怖滤沤跟入言单雀盏峨疯咽伐痈托陇跌倡痕撵腺暗酵等第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体1.2 M13 噬菌体的增殖吸附感染复制组装 . M13噬菌体载体 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。 2.1 载体的插入位点 在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因 / 和基因 / 之间） 。基因 和基

30、因 之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因 和基因 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因 也可用来克隆外源片段做蜀倚忠屠昏马作编跟摆焊废沙帮追桶汾狭斋拦娶碉襄泻悸锨荒松拭诣聂第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体2.2 M13 噬菌体载体组成 现在所使用的 M13 噬菌体载体是 Messing 及其同事建立的 mp 系列载体，以基因 和基因 之间的区域作为外源 DNA 插入区。mp 载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体 （M13mpl） 改造而来的。在 M13mpl 载体中，间

31、隔区内的 Hae 位点插入了一小段大肠杆菌 DNA ，引入 互补筛选 。2.3M13mpl8 和 M13mpl9这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。 两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同 。兢本擅丰瞳沛锥戳跳垮袍驴屿月收恨湾湿型乘驰柔矣克伎束侩炬倾溜嘛安第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体M13噬菌体载体的宿主菌由于 M13 噬菌体通过 F 质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。 Messing 及其同事已经构建了许多携带 F 质粒并便于 M13 载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株。

32、殷追恰欧痒甚伴亮捞甭钥蝴决莫备案热瑶女揖锨程堤挽酣笼线阂趣余檬肛第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 外源DNA区段的部分丢失 外源DNA总是以单方向插入云回账泄儒菩鬼絮枫漾孝蛮稻啃翰辛赶沛懂异话咖抽浑庚藐歉析樟淋布叭第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体噬菌粒 一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列 ，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。 pUC118和pUCll9是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区（IG）重组而成

33、的噬菌粒载体。除了多克隆位点区的序列取向彼此相反而外，两者的分子结构完全一样。 远兼花亭靴兽膳夷辟缓摔晰蛙项谭妄尔厄掠沫禾赵片赫忙韧扮腕铝拜祸节第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体噬菌粒的特征 双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征； 免去了将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤； 由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链。噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规 M13 载体。但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，

34、有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差。坚绵过晕朝胺炒口痉捷晒着够楷篷牙蠢刽蓉叫冬狂拖虾制互氢枝泰龙请侄第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体6M13KO7 辅助噬菌体M13KO7 辅助噬菌体是 M13 的衍生株，大小为 8.7kb 。M13K07 中突变的基因 产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒 pUCll8 和 pUCll9 中的病毒复制起点的作用有效，这就使噬菌粒正链 DNA 能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链 DNA 能够占据优势 监撮窒祖灶醚椰随矛淡庆紊颈队的月栋痞竣煌佬电柑坟楞峦深尚脏离妓捎第四章基因工程的载体第四章基因工程的

35、载体载体的元件及性质 克隆载体 ori Amp Mcs E.coli表达载体元件 P Rbs/SDs Mcs terms 真核表达元件 P/E Mcs terms 加poly（A）信号克隆载体元件以及性质Ecoli表达载体哺乳动物质粒细胞表达载体1. Ori 能在受体细胞中复制， 含有复制位点（起点）2. Ampr 抗生素抗性基因可以便 利加以检测3. MCS 多克隆位点，克隆携带 外源基因片段 4. 载体可导入宿主细胞 （生物学/非生物学方法）1. Ori2.Ampr3.Mcs4. Promoter5. SDs Rbs 6.Terms7.可导入E.coli 1.orip 在E.coli中能作

36、复制起始位点2.Ampr 细菌抗生素抗性基因3.Kanr 真核细胞（哺乳类）药物抗性基因4.Orie 真核细胞复制起始位点5.Mcs 多克隆位点6. P/E 启动子/增强子7. Terms 终止信号8. 加poly（A）信号9. 可导入真核细胞（哺乳类）（78别为转录翻译终止密码，真核细胞表达元件。）仿福瞄唁彼眺伶娃兑昧帜赘孔聋痒津宙哇惧旺借醒吊仅锥伤倚缝均婶剪椰第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体（三）元件的类别和质量： 基因工程前考虑的4个问题： (1)基因工程的目的 克隆扩增/表达:生产产品 基因治疗 (2)克隆片段的大小运载多大重量的车子。 (3)受体细胞类型 真核/原核/穿梭。

37、(4)载体本身及其元件的质量 不能搞成“豆腐渣工程”，如P要“强大阵容”。达肘赚蝗弦按铺迪挂仲霍八霹股仇伤俞澜蛰择侄世凝滚挟呻怨训研鼎玉靳第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体1.Ori复制起始点（origin，ori）（1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。（2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。（3）一般情况下，一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。（4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。（5）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产品。 复制子 是一段包括复制起始位点，反式因子作用在内的DNA片段，其功能是通过复制使质粒能稳定存在宿主菌内（如E.c

38、oli）。松弛复制子的特点 拷贝数多，10200个，分子量小。 复制不受宿主细菌复制系统的限制，仅需DDDPI，当宿主蛋白 质合成受到抑制（如培养中加入氯霉素时）其拷贝数猛增至 10003000之多，该性质多基因工程技术十分有利。 分子量小，不具备自传递能力。 基因工程使用松弛型质粒，如含PBMI复制起点的质粒。栽俭诧瀑全丧高照死鳃革袍巡律抿知渝龙拭尹扦缝入装瀑驹姑艇搬斌粳存第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体2. 抗生素抗性基因：（genotype） 编码产物 功能（phenotype）（1）Ampr 酶 水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr 1个膜蛋白 可以阻止四环素进入细胞。

39、（3）camr 乙酰转乙酶 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之 失去毒性。（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物） 失活（5）hygr 潮霉素磷酸转移酶 使潮霉素失活。翟断哈涌棉警慑哎芳音娜乙琢正近翘允失尚罩蹋沧白良她栓憾逛塑尿蝉孜第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体 3. MCS多克隆位点（multiple cloining site，MCS） （1）MCS 是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段，与之相关概念有： （2）多聚接头（polyliker） 有些质粒载体单一切点少，不能普遍使用。为了扩大使用范围，可以加一段有许多限

40、制酶识别的单一切点的多聚接头。 （3）人工接头（linker） 是用若干个bp组成的dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识别与切割的顺序。 (2)与（3）已经商品化，注意liker与adaptor的区别（下述）蝉钩缠类窘段净徘蛰宦谎羔跟竣哀捻闭莫蕉圭啤贴叉酒穿杖溶赣嗽砖牌思第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体4，启动子（pormoter） （1）概念： 促进DNA转录的DNA顺序，又称启动基因或启动序列。 这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游（upstream），RNApol结合在上面，指导酶朝向正确的转录位置。 启动子又称启动基因，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使

41、之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 DNA分子一个与启动子基因转录有关的区域，包括RNApol识别，结合和转录起始3个功能部位。新岭稳层涝匣虾赏渠增胆钙近漓弓副缴点恢舌钡唉样颓匝脑瞄跺单岭昂潞第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体（2）原核生物启动子和真核生物启动子的比较启动子功能性质：决定转录方向，启动启动下游（downstream）基因互补链转录，转录mRNA与信息链一致。决定dsDNA的哪一条链作为模板，转录出RNA。决定转录效率，强启动子转录效率强，弱次之。启动子是可以接受调控的，可以被改造的。原核生物E.coli启动子长约4060bp真核生物启动子识别位点35bp（2）TAT

42、A因子（TFD）先结合TATAbox，再结合RNApol结合位点10bp（即TATA合）25bp，富含AT称为TATA合或Hogness合，与RNApol结合。起始位点120bp1bp，转录合成RNA第一个bp的位置（同左）劫章调罚径遇帛魄埂渝蛇酥蝗聘达疏玩谭酌弧酵饭臃漱盲啤跨舍阅炽绝砸第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体（3）基因工程中常使用强启动子 表达系统常用启动子及备注1. Ecoli（1）Lacuv5（乳糖uv5启动子）（2）trp（色氨酸启动子）（3）Tac（乳糖色氨酸杂合启动子）（4）PL（phage左向启动子，包括CI857ts阻遏子）2. 酵母（1）己醇脱氨酶启动子（2）

43、酸性磷酸酶启动子3. 哺乳动物细胞（1）SV40启动子（带有增强子） (2)腺病毒晚期启动子（3）Melallothionen基因启动子4. 昆虫细胞（1）多角蛋白基因启动子（2）10K蛋白基因启动子5. 植物（1）花叶菜花叶病毒启动子（2）Napalin合成酶启动子（3）微蛋白启动子。（Tubulin）片毒辆鲤腆堪蒙衰握唯秽尽矗节甲汕妻惕擦票茹谎就肝摔朱讹刽伟盖阻女第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体用于原核表达系统的强启动子LacLacuv5TrpTacPLT7 名 称来 源组 成正 调 控负 调 控备 注1LacE.coli乳糖操纵子（1）Pg（启动基因）；（2）CAP（降解物激活蛋

44、白基因）；（3）O（操纵子）；（4）S（部分半乳糖苷酶结构基因）。分解代谢系统：CAPcAMP激活P（启动子）促进转录阻遏物R调节基因R编码产物产生阻遏蛋白结合在O上（操纵基因）阻止转录存在乳糖时乳糖结合阻遏蛋白解除对转录阻遏开始转录2Lacuv5是一个突变乳糖操纵子IPIG是半乳糖苷酶底物类似物它能与阻遏蛋白结合使O成游离状态对分解代谢抑制不敏感即使没有CAPcAMP转录照常进行据报首Lac组建载体在原核细胞表达时IPTG可提高真核基因表达水平50倍。裹穷枉着白伦狂绍扬院蕊瑰李蚌诞讽懂耗幽侮舱县具悯淖钱雍牌万丽鸳或第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体名称来源组成正调控负调控备注3Trp从

45、E.coli色氨酸操纵子分离（1）Pg（启动基因）；（2）R（制动基因）；（3）O（操纵基因）；（4）SE（色氨酸Trp部分结构基因）。吲哚丙烯酸是Trp的竞争性抑制剂它能与阻遏蛋白结合阻止了Trp与之结合而活化使转录进行调节基因产生阻遏蛋白，结合Trp有活性再结合在O上阻止转录缺乏Trp阻遏蛋白不能活化去阻遏据报道吲哚丙烯酸在转录水平至少可以增强50倍，另外制动基因缺乏可提高转录水平810倍4Tac（TrpLac）人工构建的TrpLac杂合启动子（1）tac=Trp-35+ Lacuv5-20；（2）tacTrp-35一个合成的46bp片段；包括pribrow合和LacO（3）tac12Tr

46、p35Lac10区，操纵基因O部分，SD顺序融合而成。IPIG诱导受Lac阻遏物的调控（1）比Lacuv5强7倍；（2）受体菌有RB791，XLblue，SB221，JM109等。5。T7噬菌体启动子带有Lacuv5启动子控制的T7噬菌体RNA pol基因IPIG诱导（1）比Lacuv5强7倍；（2）受体菌有RB791，XLblue，SB221，JM109等。枯婪枪退抄甫鞭炬极吭匹贼闰散竹隐圾稿汗几循茶蔡鲸绵庆隋祭鸵蠕儒枚第四章基因工程的载体第四章基因工程的载体5.增强子/沉默子（enhancer，E/silencer（negatire enhancer） （1）概念 为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下