动物细胞培养制药工艺3课件

1、生物制药工程主讲教师： 刘 凯 liukai_山东农业大学生命科学学院微生物系第八章 动物细胞培养制药工艺8.1 制药动物细胞的表达系统与特征8.2 基因工程动物细胞系的构建8.3 动物细胞培养基的制备8.4 动物细胞培养技术8.5 培养过程检测与工艺控制动物细胞体积大，无细胞壁，细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染；培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感；细胞间主要以聚集体形成存在；原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。动物细胞群体生长特点8.5 细胞培养过程的检测与工艺控制生长环境参数：温度、pH、溶氧、转速、液流量培养基成分变化参数：葡萄糖消耗率、乳酸生成率、铵离子浓度生长状态参数：形态

2、变化、活性高低、密度大小目标产物生产率：产物的合成与积累速度，分泌情况微生物的污染参数8.5.1 细胞生长状态检测与控制1、细胞数目与活性检测离线分析：用血球计数板计数，或进行分光光度计比色分析，确定反应器中细胞数目。细胞活性：组织化学染色法和细胞形态的观察测细胞活性。台盼蓝染色排除法（死细胞质膜不完整，成蓝色），MTT比色分析（增殖细胞能量代谢中，琥珀酸脱氢酶能将四甲基偶氮唑盐(MTT)还原为不溶的蓝色的甲臜结晶物质；死细胞该酶已失活。 ）在线分析：近红外线传感器，可把细胞计数和活性的控制结合在一起。2、细胞凋亡检测凋亡细胞排斥活体染料，台盼蓝不能检测。光学显微镜：直接形态观察，凋亡小体荧光

3、显微镜：荧光染料（Hoechst，Hoechst/PI，吖啶橙/溴化乙锭）染色，观察细胞核的形态。Hoechst33258染色DNA粘性3-OH末端被荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶标记A0-EB双重染色法2、细胞凋亡检测凋亡的主要生化特征是激活一种Ca2+/Mg2+依赖型的核酸内切酶，将核DNA切割成200bp或更大的片段，而坏死细胞不会出现DNA断裂片段。细胞凋亡控制细胞凋亡的化学抑制剂乙酰半胱氨酸NAC吡咯烷二硫氨基甲酸酯PDTC 半胱天冬蛋白酶Caspase抑制剂（参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游

4、和下游发挥作用。 ）Z-VAD-FMK（泛Caspase抑制剂/凋亡抑制剂 ），YVANCaspase尽管有许多信号可以诱导细胞程序死亡，但它们有一些共同的特征，其中之一是凋亡时一系列细胞内蛋白水解酶Caspase的活化。Caspase具有催化活性，“C”代表具有半胱氨酸水解酶功能，“aspase”代表具有切断天冬氨酸末端的功能。在对哺乳动物同源基因ced-3（线虫C. Elegans的细胞死亡基因）的研究中，首次发现了具有半胱氨酸水解酶活性的Caspase家族。 8.5.2 微生物污染检测与防治1、污染的检测细菌污染：肉汤培养基于37恒温培养，检查。支原体污染：染色、培养、DNA杂交和共培养

5、，至少同时使用两种方法。荧光染色在荧光显微镜下观察。2、污染的防治使用抗生素，以避免轻度污染。注意在传代及种子培养阶段不应使用抗生素，否则会掩盖早期污染。对于支原体污染，常用卡那霉素、金霉素处理培养物。卡那霉素对细胞无毒性，金霉素有较大毒性。注意一旦支原体被消除后，就要及时终止抗生素的使用，以免产生新的抗药性的支原体。特异性的支原体血清、高温（如41，支原体对热敏感）、支原体去除剂。8.5.3 培养基成分检测与代谢控制1、基质消耗的检测营养的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的减少为指示；副产物的积累：乳酸和铵离子的增加；近红外测量技术可实现葡萄糖的在线测定。控制铵离子浓度低于24 mmol/L，乳酸低于

6、60 mmol/L。2、代谢控制如果存在过量的葡萄糖，细胞将消耗90%以上葡萄糖作为乳酸分泌到培养液，即使在完全有氧条件下也如此。流加过量谷氨酰胺会导致铵离子、丙氨酸或天门冬氨酸的积累。限制葡萄糖的流加量，将减少乳酸的总量，增加葡萄糖的产量系数。限制谷氨酰胺的流加量，可减少铵盐和氨基酸的生成。如果进行双控制（同时控制葡萄糖和谷氨酰胺），乳酸和铵离子将同时减少，使细胞代谢编的更有效。生产工艺中，优化二者之间关系，使之协调。把细胞活力、ATP、DNA和蛋白质的含量，与生物量或细胞计数、底物和产物代谢变化相结合，评价代谢过程，建立调控模型，进行有效控制。对于生长速率恒定的连续培养，细胞内ATP含量与

7、生长速率相关。氨基酸的比吸收速率和比生成速率、细胞内酶（如乳酸脱氢酶，谷氨酸草酰乙酸转氨酶）的比释放速率，都可作为培养过程的瞬间参数和控制节点的阈值。如果能自动检测产物并计算产率，通过计算程序可使过程自动优化。多元参数分析的计算程序，能改变所有的相关参数，最终找到一个最佳的生产条件。8.5.4 搅拌剪切的检测与控制1、搅拌剪切的检测搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提高了氧及其他营养物质的传递速率。但搅拌产生剪切力会对哺乳动物细胞造成损伤。对细胞损伤可用悬浮培养中的胞外蛋白浓度来表征，它决定了细胞的裂解程度。最常用的是细胞质中的乳酸脱氢酶（LDH），在指数生长阶段为一常数。通过监测LDH释放

8、可评价不同搅拌对细胞损伤程度。2、搅拌剪切控制反应器设计表面通气反应器：避免漩涡。高速搅拌，安装挡板。填充反应器：无顶部气体空间，消除夹带和气泡破裂带来的剪切。鼓泡反应器：气体应该从生物反应器重移走。或使用高径比较大（至少2-3）的反应器进行悬浮培养。搅拌、鼓泡、气升反应器：使用剪切保护剂。多空微载体：用各种搅拌/混合强度检测，显微镜下检查微载体的机械损伤程度。3、转速在动物细胞培养中，搅拌速率控制在20200 rpm为宜，所以需要更慢的驱动器，即使是小范围的控制。使用剪切保护剂离子表面活性剂：聚醚F-68和F-88，0.1%，首先选用。PVA（聚乙烯醇）：研究并不广泛，但效果也很好。混合分子

9、量的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：鼓泡式反应器内的剪切损伤。血清：效果好，25%，但使蛋白质纯化变得复杂，可能病毒污染，避免使用。羧甲基纤维素：前景光明，需要做很多工作。蛋白胨、乳白蛋白水解产物、胰蛋白磷酸盐、酵母提取物、酵母水解产物等。8.5.5 溶解氧检测与控制1、溶解氧影响较大氧压范围（15%90% DO）内生长良好。低水平阻碍细胞代谢，过高，产生氧自由基，对细胞造成伤害。细胞类型、细胞密度、增殖速率、葡萄糖浓度以及谷氨酰胺浓度等都影响耗氧速率。一定溶氧范围内，耗氧速率可近似为一常数。耗氧比速率：0.050.5 mol/106细胞/h CHO为0.15；BHK-21为0.2；鼠杂交瘤：0.0

10、30.482、溶解氧控制必须保证氧浓度高于临界氧浓度，提高氧传质系数（kL）、传质面积（a）、传质动力（C）都能改善供氧。不同细胞类型的最适溶解氧水平不同2080%是一个可选范围低于20%对细胞生长不利高于80%的氧浓度对细胞有毒害加入不同比例的氧气、空气或氮气或二氧化碳溶氧量的控制常常与pH值控制结合在一起，根据需要进行调节。8.5.6 温度和pH检测与控制1、温度动物细胞对温度变化很敏感，控制要求十分严格。高灵敏温度计（0.25）在线检测。温度探头（铂100），进行反馈控制。预热培养基，或加热水套层，是温度恒定。哺乳动物细胞：37；鸡胚细胞：3940；昆虫细胞25282、pH值检测与控制开始时，pH为7.4，随着细胞产生较多CO2和乳酸，pH会下降，但不能低于7.0。精确控制pH，一般为7.07.5，其波动范围为0.050.9。直接加HCl或NaOH不适合动物细胞培养。磷酸盐缓冲液中的磷酸及高HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸，一种非离子两性缓冲液, pH 7.27.4） 对细胞有毒性。碳酸氢盐缓冲剂：加入CO2可降低pH值，加入碳酸氢盐可提高pH值。缓冲能力弱。控制DO：增加溶氧量会使培养基中CO2被置换出来，导致pH值升高。应该合理配置，达到控制目的。8.5.7 目标产物检测与控制目标产物进行跟踪检测：免疫方法测定活性。产物并非100%具有生物活性，它依赖于糖基化