高效液相色谱法6h课件

1、第五章 高效液相色谱法 高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography）还可称为高压液相色谱（High Pressure Liquide Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquide Chromatography）。 第1页，共50页。第一节 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法具有以下特点。（1）分离效能高 由于新型高效微粒固定相填料的使

2、用，液相色谱填充柱的柱效可达21035104块/米理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱103块/米理论塔板数的柱效。（2）选择性高 由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要的作用。第2页，共50页。（3）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达10-9g；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。（4）分析速度快 由于高压输

3、液泵的使用，相对于经典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。 第3页，共50页。第二节 高效液相色谱法的分类高效液相色谱法可依据溶质(样品)在固定相和流动相分离过程的物理化学原理分类。(1)吸附色谱(Adsorption Chromatography) 用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实

4、现分离。第4页，共50页。(2)分配色谱(Partition Chromatography) 用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱(Reversed Phase Chromatography)。第5页，共50页。(3)离子色谱(Ion Chromatogra

5、phy) 用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离。第6页，共50页。(4)体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。第7页，

6、共50页。(5)亲和色谱(Affinity Chromatography) 以在不同基体上，键合多种不同特性的配位体作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。第8页，共50页。第三节 高效液相色谱法的应用范围和局限性 一、应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环

7、境污染物等，约占全部有机化合物的80。其余20的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。 第9页，共50页。二、方法的局限性 第，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱法的一种通用型检测器。 第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求柱效高达10万块理论塔板数以上，

8、必需用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。 第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。 综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。 第10页，共50页。第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品仪器可有如下两种组合方式： 完全紧凑的整体系统

9、。其死体积小，灵敏度高，体现高效液相色谱仪总体实用的特点。 独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，即能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全的分析工具。 第11页，共50页。1一贮液罐；2一搅拌、超声脱气器；3一梯度淋洗装置；4一高压输液泵；5一流动相流量显示；6一柱前压力表；7一输液泵泵头；8一过滤器；9一阻尼器；10一六通进样阀

10、；11一色谱柱；12一紫外吸收(或折光指数)检测器；13一记录仪(或数据处理装置)；14一回收废液罐 高效液相色谱仪的组成第12页，共50页。一、高压输液泵 对高压输液泵的要求是：泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢（Cr1Ni8Ti9）或优质耐酸不锈钢(Cr18Nil2Mo2)。为防止酸、碱缓冲溶液的腐蚀，在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。 能在高压下连续工作。通常要求耐压4050MPacm-2，能在824h连续工作。 输出流量范围宽。对填充柱：0.1l0mLmin(分析型)；1100mLmin(制备型)。对微孔柱：101000uLmin(

11、分析型)；19900uLmin(制备型)。 输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器，大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密度应小于1，最好为0.5，重复性最好为0.5。第13页，共50页。高压输液泵可以分为如下两类： 1恒流泵 恒流泵可输出恒定体积流量的流动相。 2恒压泵 恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力的泵。 第14页，共50页。二、进样装置 （一）六通阀进样装置此阀的阀体用不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能好。当进样阀手柄置“取样”位置，用特制的平头注射器(10ul)吸取比定量管

12、体积(5ul或l0ul)稍多的样品从“6”处注入定量管，多余的样品由“5”排出。再将进样阀手柄置“进样”位置，流动相将样品携带进入色谱柱。此种进样重现性好，能耐20MPa高压。 第15页，共50页。（二）自动进样器自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按预先编制注射样品的操作程序工作。取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的转动，全部按预定程序自动进行，一次可进行几十个或上百个样品的分析。自动进样的样品量可连续调节，进样重复性高，适合作大量样品分析，节省人力，可实现自动化操作。但此装置一次性投资很高，目前在国内尚未得到广泛应用。在商品仪器(如HPll00高效液相色谱仪等)中已获广泛使用。 第16

13、页，共50页。三、色 谱 柱 （一）柱材料及规格1柱材料常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使HNO3在柱管内至少滞留l0min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层。2柱规格 一般采用直形柱管，标准填充柱柱管内径为4.6mm或3.9mm，长1050cm，填料粒度510um时，柱效达500010000块m理论塔板数。使用35um填料，柱长可减至5一l0cm。当使用内径在0.51.0mm的微孔填充柱或内径为3050um的毛细管柱时，柱长为1550cm。 当使用粗内径短柱或细内径长柱时，应注意由于柱内体积减小，

14、由柱外效应引起的峰形扩展不可忽视。此时应对进样器、检测器和连接接头作特殊设计以减少柱外死体积。这对仪器和实验技术提出了更高的要求。但这样会降低流动相的消耗量并提高检测灵敏度。 第17页，共50页。（二）柱连接方式柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒，柱出、入口的连接管的死体积亦应愈小愈好，一般常用窄孔(内径0.13mm)的厚壁(1.52.0mm)不锈钢管，以减少柱外死体积。所用柱接头，联接螺帽，密封圈及色谱柱接头皆为不锈钢材料。 1一柱接头；2一联

15、接柱螺帽；3一接连接管的螺帽； 4孔径0.45um的纤维素滤膜；5一多孔不锈钢烧结片； 6一柱密封圈(卡套)；7一连接管密封圈(卡套)； 8一色谱柱管；9连接管第18页，共50页。（三）柱温控制 在高效液相色谱分析中，温度的影响往往容易被忽略，现随分析样品复杂性和多样性的不断出现；人们对分析结果准确度和精密度的要求不断提高，柱温的控制日益受到人们的重视。在以下几种情况需精确控制柱温： 在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性。 必须通过改变柱温来提高分离效率。 对高分子化合物或粘度大的样品，分析时柱温必须高于室温。 对一些具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室温。 对某些组成复

16、杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离，需要使用二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温下操作，以实现多组分的完全分离。 一个理想的HPLC柱温控制系统，如HPll00高效液相色谱仪可以实现从低于室温10至80柱温的精确控制。对凝胶渗透色谱仪，其柱温可从室温至150实现精确控温。 第19页，共50页。四、检 测 器 高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件(高压输液泵、色谱柱、检测器)之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不敏感；不引

17、起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。 常用的检测器为紫外吸收检测器(UVD)、折光指数检测器(RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。 在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节，它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用灵敏的质量检测器。 第20页，共50页。(一)、检测器的分类和响应特性 1分类 (1)按检测的对象分类 整体性质检测器 检测从色谱柱中流出的流动相总体物理性质的变化情况。如折光指数检测器(R

18、ID)和电导检测器(CD)，它们分别测定柱后流出液总体的折射率和电导率。此类检测器测定灵敏度低，必须用双流路进行补偿测量；易受温度和流量波动的影响，造成较大的漂移和噪声；不适合于痕量分析和梯度洗脱。 溶质性质检测器 此类检测器只检测柱后流出液中溶质的某一物理或化学性质的变化。例如，紫外吸收检测器(UVD)和荧光检测器(FD)，它们分别测量溶质对紫外光的吸收和溶质在紫外光照射下发射的荧光强度。此类检测器灵敏度高，可单流路或双流路补偿测量，对流动相流量和温度变化不敏感。但不能使用对紫外线有吸收的流动相。它们可用于痕量分析和梯度洗脱。 第21页，共50页。(2)按适用性分类 选择性检测器 它对不同组

19、成的物质响应差别极大，因此只能选择性的检测某些物质，如紫外吸收检测器、荧光检测器和电导检测器。 通用型检测器 它对大多数物质的响应相差不大，几乎适用于所有物质。折光指数检测器属于通用型检测器，但它的灵敏度低，受温度影响波动大、使用时有一定局限性。 上面提到的UVD、RID、FD、ECD四种检测器皆属于非破坏性检测器，样品流出检测器后可进行馏分收集，并可与其它检测器串联使用。对荧光检测器因测定中加入荧光试剂，其对样品会产生玷污，当串联使用时应将它放在最后检测。 第22页，共50页。2检测器的性能指标性能 检测器 紫外检测器 折光检测器 荧光检测器 电导检测器测量参数 吸光度 折光指数 荧光强度

20、电导率类型 选择性 通用性 选择性 选择性线性范围 105 104 103 104 最小检出浓度 10-10 10-7 10-11 10-3最小检出量 1ng 1ug 1pg 1mg梯度洗脱 可以 不可以 可以 不可仪对流量敏感性 不敏感 敏感 不敏感 敏感对温度敏感性 低 10-4 低 2%/ 第23页，共50页。(二)、常用检测器1.紫外吸收检测器(ultravioletabsorptiondetector，UVD)是高效液相色谱仪中使用最广泛的一种检测器，它分为固定波长，可变波长和二极管阵列检测三种类型 （1）固定波长紫外吸收检测器 固定波长紫外吸收检测器，由低压汞灯提供固定波长254n

21、m(或=280nm)的紫外光。 第24页，共50页。 （2）可变波长紫外吸收检测器此检测器采用氘灯作光源，波长在190600nm范围内可连续调节。1。氘灯；2。聚光透镜；3。可旋转组合滤光镜；4。入口狭缝；5。反射镜；6。光栅；7。反射镜；8。光分束器；9。样品流通池；10。测量光电二极管；11。参比光电二极管1-流通池；2测量臂；3参比臂；4入射光第25页，共50页。（3）光二极管阵列检测器 (photodiodearray detector，PDAD)是上个世纪80年代发展起来的一种新型紫外吸收检测器。它与普通紫外吸收检测器的区别在于进入流通池的不再是单色光，获得的检测信号不是在单一波长上

22、的，而是在全部紫外光波长上的色谱信号。因此它不仅可进行定量检测，还可提供组分的光谱定性的信息。 第26页，共50页。2.折光指数检测器折光指数检测器(refractiveindexdetector，RID)又称示差折光检测器(DRD)，它是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度的检测器。由于每种物质都具有与其他物质不相同的折射率，因此RID是一种通用型检测器。此类检测器一般不能用于梯度洗脱，因为它对流动相组成的任何变化都有明显的响应，会干扰被测样品的监测。此检测器的普及程度仅次于紫外吸收检测器。折光指数检测器对温度变化敏感，使用时温度变化要保持在0.001 范围内。此检测器

23、对流动相流量变化也敏感，其灵敏度较低，不宜用于痕量分析。 第27页，共50页。3.电导检测器电导检测器(electrical conductivity detector，ECD)是一种选择性检测器，用于检测阳离子或阴离子，其在离子色谱中获得广泛应用。由于电导率随温度变化，因此测量时要保持恒温。它不适用于梯度洗脱。4.荧光检测器 荧光检测器（fluorescence detector, FD）是利用某些溶质在紫外光激发后，能发射可见光（荧光）的性质来进行检查的。它是一种具有高灵敏度和高选择性的检测器。对不产生荧光的物质，可使其与荧光试剂反应，制成可发生荧光的衍生物再进行测定。荧光检测器的灵敏度比

24、紫外吸收检测器高100倍，当要对痕量组分进行选择性检测时，它是一种有力的检测工具。但它的线性范围较窄，不宜作为一般的检测器来使用的，可用于梯度洗脱。测定中不能使用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂作流动相。对不能直接产生荧光的物质，要使用色谱柱后衍生技术，操作比较复杂。此检测器现已在生物化工、临床医学检验、食品检验、环境监测中获得广泛的应用。 第28页，共50页。5.蒸发激光散射检测器在高效液相色谱分析中，人们一直希望能有一台像FID那样的通用型质量检测器，它能对各种物质均有响应，且响应因子基本一致，它的检测不依赖于样品分子中的官能团，且可用于梯度洗脱。目前最能接近满足这些要求的就是蒸发激光散射检测

25、器(evaporation laser scattering detector，ELSD)。第29页，共50页。下图为蒸发激光散射检测器工作原理示意图。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气(N2)喷成雾状液滴。在受温度控制的蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，溶质形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测系统。检测系统由一个激光光源和一个光二极管检测器构成。在散射室中，光被散射的程度取决于散射室中溶质颗粒的大小和数量。粒子的数量取决于流动相的性质及喷雾气体和流动相的流速。当流动相和喷雾气体的流速恒定时，散射光的强度仅取决于溶质的浓度。此检测器可用于梯度洗脱。且响应值仅与光束中溶质颗粒的大小和数量

26、有关，而与溶质的化学组成无关。1-HPLC柱；2-喷雾气体；3-蒸发漂移管；4-样品液滴； 5-激光光源；6-光二极管检测器；7-散射室 第30页，共50页。6. 色谱数据处理装置 (1)微处理机 (2)色谱工作站 主要功能为： 自行诊断功能 可对色谱仪的工作状态进行自行诊断，并能用模拟图形显示诊断结果，可帮助色谱工作者及时判断仪器故障并予以排除。全部操作参数控制功能 色谱仪的操作参数，如柱温、流动相流量、梯度洗脱程序、检测器灵敏度、最大吸收波长、自动进样器的操作程序、分析工作日程等，全部可以预先设定，并实现自动控制。智能化数据处理和谱图处理功能 可由色谱分析获得色谱图，打印出各个色谱峰的保留

27、时间，峰面积、峰高、半峰宽，并可按归一化法、内标法、外标法等进行数据处理，打印出分析结果。谱图处理功能包括谱图的放大、缩小，峰的合并、删除、多重峰迭加等。使用专用的多种色谱参数的计算和绘图软件，可计算柱效、分离度、Kovats保留指数、拖尾因子，并可绘制标准工作曲线、范第米特曲线，还可进行仿真模拟等操作。 第31页，共50页。进行计量认证的功能 工作站储存有对色谱仪器性能进行计量认证的专用程序，可对色谱柱控温精度、流动相流量精度、氘灯和氙灯的光强度及使用时间、光吸收波长校正、检测器噪声、自动进样器的线性等进行监测，并可判定是否符合计量认证标准。控制多台仪器的自动化操作功能 HP DOS色谱工作

28、站，可控制四套HPLC系统，并完成全部HPLC方法的设定、运行、打印报告及串联运行，并可与INTERNET连接进行数据传输或仪器远程诊断。网络运行功能 用一台高档微型计算机，配备用Windows NT构成的专用软件，作为服务器(Server)，可将同一实验室的色谱工作站连成局域网络。服务器使用两种专用软件，一种是从事实验室管理的Chem Access软件，它可传输或交换数据、监控仪器的工作状态，以提高工作效率。另一种是具有数据库功能的Chem Store软件，它可对数据进行归纳、统计处理、分类。服务器也可与INTERNET连接，构成广域网络。 第32页，共50页。第五节 建立高效液相色谱分析方

29、法的一般步骤 高效液相色谱法用于未知样品的分离和分析，主要采用吸附色谱、分配色谱、离子色谱和体积排阻四种基本方法；对生物分子或生物大分子样品还可采用亲和色谱法。 当用高效液相色谱去解决一个样品的分析问题时，往往可选择几种不同的HPLC方法，而不可能仅用一种HPLC方法去解决各式各样的样品分析问题。 一种高效液相色谱分析方法的建立，是由多种因素来决定的，除了了解样品的性质及实验室具备的条件外，对液相色谱分离理论的理解、对前人从事过的相近工作的借鉴以及分析工作者自身的实践经验，都对分析方法的建立起着重要的影响。 第33页，共50页。 通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解

30、决以下问题： 根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格(柱内径及柱长)和选用固定相(粒径及孔径)。 选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方法。 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 显然已被选择的分析方法应具备适用、快速、准确的特点，要能充分满足分析目的的需求。 第34页，共50页。一、样品的性质及柱分离模式的选择（一）、样品的溶解度 由样品在有机溶剂中溶解度的大小，初步判断样品是非极性化合物还是极性化合物，进而推断用非极性溶剂戊烷、己烷、庚烷等，还是极性溶剂二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等来溶解样品

31、，并通过实验判断。 若样品溶于非极性溶剂，表明样品为非极性化合物，通常可选用吸附色谱法或正相分配色谱法、正相键合相色谱法进行分析。第35页，共50页。若样品溶于极性溶剂或相混溶的极性溶剂，表明样品为极性化合物，通常可选用反相分配色谱法或更为广泛应用的反相键合相色谱法进行分析。若样品溶于水相，可首先检查水溶液的pH值，若呈中性为非离子型组分，常可用反相(或正相)键合相色谱法进行分析。第36页，共50页。若pH呈弱酸性，可采用抑制样品电离的方法，在流动相中加入H2S04、H3PO4调节pH23，再用反相键合相色谱法进行分析。若pH值呈弱碱性，则可向流动相中加入阳离子型反离子，再用离子对色谱法进行分

32、析。若pH呈强酸性或强碱性，则可用离子色谱法进行分析。对呈强离子型水溶性生物大分子的分析仍是高效液相色谱的特殊难题之一，近年随凝胶过滤色谱和高效亲和色谱的迅速发展，对解决像蛋白质、核酸等生物大分子的分析提供了有效的途径。 第37页，共50页。（二）、样品的分子量范围 选择分析方法的另一个重要信息是了解样品分子的大小或分子量范围，这可通过体积排阻色谱法获得相关的信息。根据体积排阻色谱固定相的性质，即可对水溶性样品又可对油溶性样品进行分析。对油溶性样品若分析结果表明样品分子量小于2000，且分子量差别不大，应进一步判定其为非离子型还是离子型。若为非离子型，则应考虑其是否为同分异构体或具有不同极性的

33、组分，此时可采用吸附色谱法或键合相色谱法进行分离；若为离子型，则可用离子对色谱法进行分析。若分析结果表明样品分子量小于2000，且分子量差别很大，则仅能用刚性凝胶的凝胶渗透色谱法或键合相色谱法进行分析。若油溶性样品的分子量大于2000，则最好采用聚苯乙烯凝胶的凝胶渗透色谱法进行分析。 第38页，共50页。对水溶性样品若分析结果表明样品的分子量小于2000，且分子量差别不大，可考虑选用吸附色谱法或分配色谱法进行分析。若分子量差别较大，只能选用刚性凝胶的凝胶过滤色谱进行分离；若分子量差别较大，且呈离子型，对强电离的可使用离子对色谱法进行分离，对弱电离的可使用离子色谱法进行分析。若分析结果表明样品的

34、分子量大于2000，则可采用以聚醚为基体凝胶的凝胶过滤色谱法进行分析。 第39页，共50页。（三）、样品的分子结构和分析特性 对样品的来源及组成有了初步了解后，应进一步考虑样品的分子结构和分析特性对选择分析方法的影响。 1同系物的分离 同系物都具有相同的官能团，表现出相同的分析特性，其分子量呈现有规律的增加。对同系物可采用吸附色谱法、分配色谱法或键合色谱法进行分析。同系物在谱图上都表现出随分子量的增加，保留时间增大的特点，无需使用提高柱效的方法来改善各组分间的分离度。 第40页，共50页。2同分异构体的分离 对于双键位置异构体(即顺反异构体)或芳香族取代基位置不同邻、间、对位异构体，最好选用吸

35、附色谱法进行分离。此时可充分用硅胶吸附剂对异构体具有高选择性的特点，来实现满意的分离，参见图硝基苯胺异构体的分离。 硝基苯胺异构体在10um 氧化铝上的HPLC图 UVD 254nm 1-邻硝基苯胺 2-间硝基苯胺 3-对硝基苯胺 第41页，共50页。3对映异构体的分离当前对具有特殊选择性的对映异构体的分离，已成为高效液相色谱法研究的热点，它在高疗效的新型药物的质量检验中非常重要。使用通常的高效液相色谱方法无法将对映异构体分离，必须使用具有光活性的固定相(如键合-环糊精或含手性基的杯环芳烃衍生物)或在流动相中加入手性选择剂，才能将它们分离，有关此领域的研究可参见近期发表的文献资料。 第42页，

36、共50页。4生物大分子的分离 对像蛋白质、核酸这类生物大分子，应首先了解它们的结构特点。如蛋白质的分子量一般在120万之间，这类大分子的扩散系数要比小分子低12个数量级，蛋白质是由氨基酸缩聚构成的肽链进一步连接生成的大分子，其分子侧链连接有羟基、巯基、羧基、氨基等多种亲水基团，表面呈亲水性。分析蛋白质可采用反相键合相色谱法，其可实现对不同蛋白质的良好分离。但所用流动相中的甲醇、四氢呋喃和乙腈会使蛋白质分子变性而丧失生物活性，因此更宜采用凝胶过滤色谱法或亲和色谱法对蛋白质进行分析。 第43页，共50页。二、 分离操作条件的选择（一）、容量因子和死时间的测量 在HPLC分析中，容量因子k，是一个非

37、常重要的参数，它对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作用。 容量因子可按下式计算： 式中，tR为调整保留时间；tM为死时间。tR为保留时间tR与死时间tM的差值： tR=tR-tM 由此可知欲测量K，必须准确测定tR和tM.在HPLC分析中，死时间tM的测量是一个比较困难的问题，这也直接影响了高精度Kovats保留指数在HPLC中的应用。死时间表示了一个在高效液相色谱固定相上未被滞留组分的保留时间，由于高效液相色谱方法的多样性，很难找到像气相色谱那样选择空气或甲烷作为测量死时间的通用探针。 第44页，共50页。在HPLC分析中，为测定死时间tM，可以采用以下几种方法：1.由色谱柱的结构参数进行计算 Lr2TtM= F式中，L为柱长，cm；r为柱内径半径，cm；F为流动相体积流速，cm3s；T为总孔率，对全多孔固定相为0.84，对化学键合固定相、离子交换剂为0.75，对薄壳型固定相为0.42。2.由色谱柱的操作参数进行计算 L2