大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定

1、噬菌体的分离纯化及效价的测定1目的了解噬菌体效价的含义及其测定原理。学会检查噬菌体的方法。掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。2原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可

2、以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。噬菌体的效

3、价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。3材料菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体（从阴沟或粪池污水中分离）。培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管5mL）,下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。3.3仪器和器具无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管（1、5mL），恒

4、温水浴锅，离心机等。4流程噬菌体的分离纯化鉴定噬菌体效价的测定5方法噬菌体的检查样品采集将23g土样或5mL水样（如阴沟污水）放入灭菌三角瓶中，加入对数生长期的敏感指示菌（大肠杆菌）菌液35mL，再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。增殖培养30C振荡培养1218h,使噬菌体增殖。5.1.3噬菌体的分离制备菌悬液取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。增殖培养于100ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200ml与大肠杆菌悬液2ml,37C培养1224小时。制备裂解液将以上混合培养液2500r/min离心15分钟。将以灭菌的蔡氏过滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤

5、瓶上，用橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶，安全瓶再连接于真空泵(如图2)。图上的真空表接或不接均可。将离心上清夜倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液倒入灭菌三角瓶内，37C培养过夜，以作无菌检查。确证试验经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在。于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，里37C培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。噬菌体的纯化(1)如果已证明确有噬菌体的存在，便用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1毫升大肠杆菌悬液，使混

6、合均匀。(2)取上层琼脂培养基，溶化并冷至48C(可预先溶化、冷却，放48C水溶箱内备用)，加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2毫升，立即混匀。(3)并立即倒人底层培养基上，混匀。置37C培养12小时。(4)此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37C培养。等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。(以上(1)(2)(3)三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌实验的同时，由教师先做顶备试脸，若平板上的噬菌体连成一片，

7、则需减少接种量(少于一环)或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。以免全班同学重做)。5.1.4生物测定法双层琼脂平板法倒下层琼脂融化下层培养基，倒平板(约10mL/皿)待用。倒上层琼脂融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50C左右时，每管中加入敏感指示菌(大肠杆菌)菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.20.5mL,混合后立即倒入上层平板铺平。恒温培养30C恒温培养612h观察结果。观察结果如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑?噬菌斑。5.1.4.2单层琼脂平板法省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%,融化后冷却至45C左右，如同上法加入指示菌

8、和检样，混合后迅速倒平板。30C恒温培养616h后观察结果。5.1.5离心分离加热法(快速检查)取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液，4000rpm离心20min,分别取两组发酵液的上清液（A1）,部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A2）,检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。噬菌体效价的测定5.2.1倒平板将融化后冷却到45C左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。稀释噬菌体按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，

9、注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。噬菌体与菌液混合将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37C水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。5.4.4接种上层平板将11支融化并保温于45C的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒

10、入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37C培养。5.5观察并计数观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。计算公式：N=Y/V?X（N：效价值，Y：平均噬菌斑数/皿，V：取样量，X：稀释度）例如：当稀释度为10-6时，取样量为0.1mL/皿，同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：N=186/0.1X10-6=1.86X109。结果噬菌体检查离心分离加热法处理方法OD650光密度值正常发酵液（对照）异常发酵液（试验）离心上清液（A1）离心上清液加热煮沸后（A2

11、）A2/A1绘出平板上的噬菌斑检测结果，指出噬菌斑和宿主细菌。噬菌体效价测定6.2.1平板上噬菌斑数目噬菌体稀释度10-410-510-6对照噬菌斑数（个）/皿平均每皿噬菌斑数目6.2.2计算噬菌体效价（即噬菌斑形成单位pfu,plague-formingunit）.思考1有哪些方法可检查发酵液中确有噬菌体存在？比较其优缺点。2测定噬菌体效价的原理是什么？要提高测定的准确性应注意哪些操作？扶.AJ的FBWV像菌株的其他遗传特性一样，溶原性通常也是菌株的一种非常稳定的特性。因此在大多数溶原细菌细胞群体中，只有极少数溶原菌会丢失它们的噬菌体，失去的原因尚不很清楚。溶原性细胞经诱导也可变成“烈性”状

12、态，即也可复制和溶解寄主细胞并释放出正常的有感染力的噬菌体。另外，溶原菌对于同一种噬菌体或是与之密切相关的噬菌体表现出免疫性，即它不能再被同一种噬菌体所裂解或溶原化。但免疫性不同于细菌对噬菌体的抗性，抗性是由于细胞表面受体部位结构的改变而使得噬菌体不能吸附。溶原性细菌易识别，只要把溶原细菌在固体培养基上划线，当划过一个对噬菌体敏感的菌株时，沿着溶原性细菌的边界处可以看到一个窄的裂解区。当溶原性细菌被强烈因素处理时，也易于转变为烈性。此外，许多菌株可被几个不同的噬菌体溶原化。四、噬菌体的分离检查噬菌体具有非常专一的寄生性，它只能在特异的寄主细胞中增殖。另外，噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄

13、主而自行繁殖。因而噬菌体的繁殖必须依赖于寄主细胞的繁殖，它只能在活的、正在繁殖阶段的细胞中繁殖；而在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中，或在代谢产物或培养基上均不能繁殖。为此，必须采用特殊的方法对噬菌体进行分离检查。（一）分离方法1分离样品的制备1）分离源为液体时，可进行一次离心分离，即在10000r/min的转速下分离lOmin,除去杂菌，用上清液作为分离样品。2）对于土壤等固体材料，可先取12g固体悬浮于510mL培养基内，然后取离心上清液为样品。3）以溶原菌的培养液作为样品时，考虑到诱导噬菌体的产生，可用紫外线或丝裂霉素C处理后，再进行培养。4）要从设备或容器的表面分离噬菌体，可先用灭菌

14、棉签用力地擦拭容器的表面，然后将棉签放入23ml培养基充分洗脱。以此液体作为分离样品。5）由空气中分离噬菌体时，可用真空泵抽引，使空气进入培养基内，此经捕集的培养基即可作为分离样品，而在噬菌体密度高的位点，只要将长了寄主菌的平皿打开，在空气中暴露3060min即可。经制备后的样品中噬菌体含量太少时，可将样品放在寄主菌液内培养适当时间，使噬菌体繁殖。为避免杂菌增殖，可加入过滤的样品或采用抗链霉素的寄主菌，在加链霉素的情况下进行培养。有两种以上噬菌体存在时，培养时间短，以免增殖速度慢的噬菌体为增殖快的噬菌体所压倒。当然，也可用膜滤器浓缩。2寄主细胞的培养在分离噬菌体时，可采用能使噬菌体增殖到一般程

15、度的培养基。若菌的生长过于旺盛，有时反而不会形成噬菌斑。因为有的噬菌体的吸附和增殖要求有特殊的物质，所以最好用含蛋白胨、酵母膏等的半合成培养基，并在其中补加10-3mol/L的Ca2+和10-2mol/L的Mg2+。当难以做出选择时，可先用补加Ca2+的无糖肉汁培养基试试。3分离方法预先分别配制含2和1琼脂的下层培养基和上层培养基，在固化下层琼脂培养基的平皿中将融化的上层软琼脂培养基与寄主细胞混合，并使其布满平皿，然后用接种环、毛细管或微量吸管取样品在培养皿上点1225个点，待液体被培养基吸收后培养过夜，检查点样部位有无噬菌斑出现。噬菌体少时，噬菌斑集中；有时噬菌体量太多，看不到噬菌斑，尤其是

16、那些取自溶原菌的样品。此时可同时检查原液和稀释液，就不至于造成这种情况。也可不用改变稀释度的方法进行检查，而是以接种环取样品原液点在涂有菌的平皿的一角上，然后进行连续弯曲的划线。样品数量特别多时，可将几个样品混合后进行检查，然后舍弃阴性试样。由溶原菌分离噬菌体可用大型接种环取敏感菌的菌悬液在平皿上划两条线，然后将待试的噬菌体的悬浮液与一条直线交叉划八字横线，经适当剂量的紫外线照射后进行培养，检查交叉处有无噬菌斑出现。（二）噬菌体的纯化和噬菌斑的形状用接种针挑取单个的噬菌斑，将黏着的噬菌体悬浮在1mL培养基内，经适当稀释后，再使之重新形成噬菌斑（图2-133）。再反复进行此操作，直至证实其为纯的

17、噬菌体为止。噬菌斑的形状因噬菌体种类而异，但可归纳为如图2-134所示的几种基本的形状。噬菌斑的大小不等。有的小如针尖，一般称为针孔状噬菌体，有的直径达1015mm,即使是同一种噬菌体，其噬菌斑大小也会因培养基组成和pH值、软琼脂培养基数量和琼脂浓度、菌龄和菌数、平板培养温度和时间等条件的不同而异。即使在同一条件下，其大小也往往不同。总之，在分离噬菌体时，必须注意观察噬菌斑的形状。如按照上述方法，使形状、大小不同的噬菌斑再产生噬菌斑，便可大体了解样品中存在的噬菌体种类。噬菌体(bacteriophage)是一类侵害细菌(包括放线菌)的病毒，又称细菌病毒(bacterialvirus)。具有其他

18、病毒的共同特性：个体小、可通过除菌滤器、没有细胞结构、非常专一的寄生性等，为非细胞生物。其结构主要由蛋白质和核酸(DNA或RNA)组成。在自然界中分布广泛，土壤、空气、水中或生物体内都可存在。据噬菌体与寄主细胞的关系可分为烈性噬菌体(virulentphage)和温和噬菌体(temperatephage)两类。前者改变寄主的性质，大量产生新的噬菌体，最后导致菌体裂解死亡；后者可因生长条件的不同，即可引起寄主细胞的裂解死亡，又可将其核酸整合到细菌的染色体上，使细菌细胞继续生长繁殖，并被溶原化。噬菌体的危害主要存在于发酵工业，如乳制品、酶制剂、氨基酸、有机溶剂、抗生素、微生物农药和菌肥生产等。由于

19、它的个体比细菌小数百倍，可以附着于尘埃上随风飘移，因此能长久地扩散和传播到一定的范围，并能脱离寄主而存活。它在寄主细胞内能大量迅速繁殖子代噬菌体，如在十几分钟至一个小时左右，一个细胞感染一个噬菌体后可以释放出数十个至数百个子代噬菌体。一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒罐，使工业生产遭到严重损失。由于噬菌体的结构比细菌和高等细胞简单，故广泛用于复制、转录和调节机理的研究。入噬菌体以原噬菌体方式存在于大肠杆菌K12株系中，利用紫外线诱导可以释放入噬菌体,可感染已经丧失了入噬菌体的大肠杆菌株系。入噬菌体在大肠杆菌中可裂解生长或整合到寄主染色体中复制。入-DNA可在体外包装成病毒颗粒，高效地感染大

20、肠杆菌；可以把25kb长的外源DNA插入入-DNA，引入受体细胞；另外重组入-DNA的筛选和保藏较易，故常作为分子克隆的载体。一、噬菌体的形态和构造从形态学上可将噬菌体分为六群，其中1、2、3群有头部、尾部之分，为蝌蚪形：4、5两群没有尾部，是微球形，6群为纤维形噬菌体，是一条略呈弯曲的纤丝。目前我国谷氨酸发酵中所发现的噬菌体，均属蝌蚪形(图2-125)。图2-125谷氨酸发酵侵染的噬菌体侵染棒杆菌的一种噬菌体具有头部和尾部，头部呈明显的六边形，头部大小约为55nm。它是一种非收缩尾噬菌体，尾部呈杆形或弯曲，长约193nmX12nm。尾部末端可看到六个明显的钉状刺突，其中三个在一个平面上，另外

21、三个在另一个平面上，两个平面互相平行，且垂直于尾。六个刺突在垂直投影面上形成六个角。一种具有收缩性尾部的T噬菌体形态见图2-126。图2-126具有收缩性尾部的T噬菌体形态T奇数噬菌体有多种，已报道的侵染北京棒杆菌的噬菌体有四种，这四种噬菌体是A2、A3、A133和A155。A133是收缩尾，A2、A3和A155是非收缩尾。尚未报道这四种噬菌体的尾端有刺突。噬菌体的形态特征及其寄主见表2-22。表2-22噬菌体的形态特征及其寄主形态及特征*大肠杆菌噬菌体举例其他菌种噬菌体02XDNA收缩性尾部夙金T2、T4、T6（DNA：1.2X108,头部=95nmX65nm，尾部=20nmX110nm）假

22、单胞杆菌属12S，PB-1；芽抱杆菌属SP50；黏球菌属MX-1；沙门氏菌属66tQ2XDNA非收缩性尾部”Tl,T5，久（DNA：3.5X107,头部=54nm，尾部=10nmX140nm假单胞杆菌属PB-2棒杆菌属B链霉菌属K02XDNA非收缩性短尾T4，T7（DNA：2.4X107，头部=47nm，尾部=10nmX15nm）假单胞菌属12B土壤杆菌属PB-100沙门氏菌属P221XDNA无尾部，顶端衣壳粒蛋白质较大0X174，SB（DNA：1.7X105,直径=30nm）沙门氏菌属0R1XDNA无尾部，衣壳粒蛋白质大小一致T2、MST、QB（RNA：9X105,直径=24nm）假单胞菌属

23、7S1XDNA无头部，J线状噬菌体占fd，fl（DNA：1.3X106，直径=6nmX800nm）假单胞菌属*形态大小不成比例。噬菌体的化学成分绝大部分是核酸和蛋白质，它们占粒子重量的90以上，其中核酸占40%50%,多数噬菌体的核酸是单链或双链DNA,但近十多年来，发现不少的噬菌体所含的核酸就是RNA。噬菌体的外壳由蛋白质组成。二、噬菌体的生长和繁殖噬菌体的生长和繁殖过程包括五个步骤，即吸附（adsorption）、侵入（injection）、增殖（replication）、成熟（maturity）和释放（release）（图2T27）。（一）吸附吸附是噬菌体的吸附器官（尾丝、基板和刺突）与

24、敏感寄主细胞的特殊位点的接触（图2-128）。尾丝首先触及寄主细胞表面，然后基板和刺突固定。一般说，噬菌体对寄主要求专一性很强，比如，产谷氨酸的北京棒杆菌噬菌体就严格地限于侵染北京棒杆菌。但也有些噬菌体也可以感染相近的种或属的菌株，如四环素生产菌的噬菌体。敏感的细胞并非整个细胞各处皆可吸附，须在特殊位点，而且大肠杆菌的受点还依噬菌体而异T3、T4和T7噬菌体的特殊位点是脂多糖层；T2和T6是脂蛋白质，雄性专一噬菌体是F+细胞的纤毛。当然，噬菌体吸附的寄主细胞和特殊位点的专一性并非一致，程度有差异。皿冷忖半的图2-127噬菌体的生长和繁殖过程（烈性过程）图2-128大肠杆菌表面吸附的T4噬菌体（

25、二）侵入吸附后，尾丝收缩，感染过程开始，对T类噬菌体就开始收缩尾鞘，结果不仅尾髓插入细胞壁，而且会像注射一样将DNA打入细胞内。蛋白质的外壳仍在壁外，而线状噬菌体fd则全部进入寄主细胞。从吸附到侵入时间很短，如T4仅需15s（图2-129）。图2-129噬菌体吸附在寄主细胞壁上并侵入三）增殖噬菌体一侵入，增殖即开始，即核酸的复制和蛋白质的合成。先利用寄主的RNA聚合酶转录，噬菌体的mRNA被寄主的蛋白质合成体系翻译，形成一系列新的早期蛋白质。在T类噬菌体中，早期蛋白质包括一种新的DNA聚合酶，分解寄主的DNA的核酸酶，合成5-羟甲基胞嘧啶和它的ATP所必需的酶，以及转录形成后期蛋白质基因所需的

26、蛋白质。然后开始噬菌体核酸的复制。在含有双股DNA的噬菌体中，复制过程与一般DNA复制相似。在含单股DNA的噬菌体如0X174中，一条互补的DNA被合成，形成了双股DNA，接着再以此作模板合成RNA和子代DNA。第二步是后期蛋白质开始出现。在T类噬菌体中，合成的后期蛋白质是噬菌体头和尾成分的亚单位，还有噬菌体的溶菌酶。这种酶能分解寄主细胞壁的肽聚糖。（四）成熟当所有噬菌体结构成分都已合成时，成熟过程（即“装配”）便开始。在T4中，装配一个成熟噬菌体约需30种不同的蛋白质，而且至少具有47种基因功能。其过程先是DNA的凝聚，头的亚单位被组装成头部，尾和尾丝也各自组成。然后按从头至尾的顺序自我装配

27、，最后将尾丝装上，形成一个完整的噬菌体（图2-130）。（五）释放噬菌体繁殖的最后阶段是裂解释放出子代噬菌体。裂解T类噬菌体感染的细胞要涉及两个或更多基因的作用，至少一个作用于细胞膜，另一个具有溶菌酶的作用将分解壁的肽聚糖，线状噬菌体则不裂解寄主细胞，可能是通过挤压而冲出细胞壁。每种噬菌体侵入敏感细胞，每个细胞最后能装配完成和释放出的噬菌体数称为裂解量，它是相对固定的。如T4为100，0X174为1000，f2为10000，T2为200；谷氨酸产生菌的噬菌体为50150。图2-131为噬菌体一步生长曲线，这是定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。实验时必须用噬菌体去感染高浓度的寄主细胞，以保证

28、每个细胞所吸附的噬菌体至多只有一个。由于众多寄主细胞的裂解不可能同步，所以释放期较长。wnQ諳处矗DNA團城關呃解UNA图2-130噬菌体的组装ion60时何-min掾丰轴胞噬韻体關野放烟潜优期图2-131噬菌体一步生长曲线（六）噬菌体效价的测定效价（titre）在这里的含义是表示每毫升试样中所含具有感染性噬菌体的数量，也称噬菌斑形成量（plaque-formingunit）。测定效价的方法常用双层平皿法。在已倒2琼脂下层的平皿上，将1琼脂上层培养基与敏感寄主细胞和噬菌体试样稀释液混匀凝固后，37C培养10多个小时，平皿表面会形成具有一定形状、大小和透明度的噬菌斑。由于一个噬菌体先侵染一个细胞

29、，然后以此为起点再反复侵染周围大量细胞，结果形成可观察到的一个噬菌斑。据知一个直径2mm的噬菌斑含有107109个噬菌体。三、噬菌体的生活史噬菌体有两类，大多数噬菌体是烈性的，如T4、T7、0X174等，它们在生长循环结束时就杀死细胞，其过程就像整个生长繁殖过程。不过，在自然界还存在另一种噬菌体，称为温和性噬菌体。温和性噬菌体感染一个敏感细菌菌株时，根据各种遗传和生理条件，有两种可能的行为，即一些细胞被噬菌体增殖所裂解，而另一些则被溶原化。温和性噬菌体侵入寄主细胞后，由于前者的基因组整合到后者的DNA上，并随寄主细胞的复制而进行同步复制，不引起寄主细胞裂解的现象称“溶原化”。能引起溶原化的噬菌

30、体即称温和性噬菌体，已整合到寄主DNA上的噬菌体就称“原噬菌体”，这时的寄主就称“溶原菌(lysogenicbacteria)。以“原噬菌体”的方式嵌存于寄主的DNA中，可随寄主繁殖，延续传代，“和平共处”，一般不引起细胞裂解。产生溶原化的菌株的命名方法是，在菌株名称后加上括号，括号内是它们所携带的原噬菌体的名称。如E.coli(入)，入即为大肠杆菌菌株携带的原噬菌体。温和性噬菌体的生活史如图2-132所示。嗤関休IgA成籍艸柱iffJS化图2-132温和性噬菌体的生活史像菌株的其他遗传特性一样，溶原性通常也是菌株的一种非常稳定的特性。因此在大多数溶原细菌细胞群体中，只有极少数溶原菌会丢失它们

31、的噬菌体，失去的原因尚不很清楚。溶原性细胞经诱导也可变成“烈性”状态，即也可复制和溶解寄主细胞并释放出正常的有感染力的噬菌体。另外，溶原菌对于同一种噬菌体或是与之密切相关的噬菌体表现出免疫性，即它不能再被同一种噬菌体所裂解或溶原化。但免疫性不同于细菌对噬菌体的抗性，抗性是由于细胞表面受体部位结构的改变而使得噬菌体不能吸附。溶原性细菌易识别，只要把溶原细菌在固体培养基上划线，当划过一个对噬菌体敏感的菌株时，沿着溶原性细菌的边界处可以看到一个窄的裂解区。当溶原性细菌被强烈因素处理时，也易于转变为烈性。此外，许多菌株可被几个不同的噬菌体溶原化。四、噬菌体的分离检查噬菌体具有非常专一的寄生性，它只能在

32、特异的寄主细胞中增殖。另外，噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行繁殖。因而噬菌体的繁殖必须依赖于寄主细胞的繁殖，它只能在活的、正在繁殖阶段的细胞中繁殖；而在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中，或在代谢产物或培养基上均不能繁殖。为此，必须采用特殊的方法对噬菌体进行分离检查。（一）分离方法1分离样品的制备1）分离源为液体时，可进行一次离心分离，即在10000r/min的转速下分离lOmin，除去杂菌，用上清液作为分离样品。2）对于土壤等固体材料，可先取12g固体悬浮于51OmL培养基内，然后取离心上清液为样品。3）以溶原菌的培养液作为样品时，考虑到诱导噬菌体的产生，可用紫外线或丝裂霉素C

33、处理后，再进行培养。4）要从设备或容器的表面分离噬菌体，可先用灭菌棉签用力地擦拭容器的表面，然后将棉签放入23ml培养基充分洗脱。以此液体作为分离样品。5）由空气中分离噬菌体时，可用真空泵抽引，使空气进入培养基内，此经捕集的培养基即可作为分离样品，而在噬菌体密度高的位点，只要将长了寄主菌的平皿打开，在空气中暴露3O6Omin即可。经制备后的样品中噬菌体含量太少时，可将样品放在寄主菌液内培养适当时间，使噬菌体繁殖。为避免杂菌增殖，可加入过滤的样品或采用抗链霉素的寄主菌，在加链霉素的情况下进行培养。有两种以上噬菌体存在时，培养时间短，以免增殖速度慢的噬菌体为增殖快的噬菌体所压倒。当然，也可用膜滤器

34、浓缩。2寄主细胞的培养在分离噬菌体时，可采用能使噬菌体增殖到一般程度的培养基。若菌的生长过于旺盛，有时反而不会形成噬菌斑。因为有的噬菌体的吸附和增殖要求有特殊的物质，所以最好用含蛋白胨、酵母膏等的半合成培养基，并在其中补加10-3mol/L的Ca2+和10-2mol/L的Mg2+。当难以做出选择时，可先用补加Ca2+的无糖肉汁培养基试试。3分离方法预先分别配制含2和1琼脂的下层培养基和上层培养基，在固化下层琼脂培养基的平皿中将融化的上层软琼脂培养基与寄主细胞混合，并使其布满平皿，然后用接种环、毛细管或微量吸管取样品在培养皿上点1225个点，待液体被培养基吸收后培养过夜，检查点样部位有无噬菌斑出

35、现。噬菌体少时，噬菌斑集中；有时噬菌体量太多，看不到噬菌斑，尤其是那些取自溶原菌的样品。此时可同时检查原液和稀释液，就不至于造成这种情况。也可不用改变稀释度的方法进行检查，而是以接种环取样品原液点在涂有菌的平皿的一角上，然后进行连续弯曲的划线。样品数量特别多时，可将几个样品混合后进行检查，然后舍弃阴性试样。由溶原菌分离噬菌体可用大型接种环取敏感菌的菌悬液在平皿上划两条线，然后将待试的噬菌体的悬浮液与一条直线交叉划八字横线，经适当剂量的紫外线照射后进行培养，检查交叉处有无噬菌斑出现。（二）噬菌体的纯化和噬菌斑的形状用接种针挑取单个的噬菌斑，将黏着的噬菌体悬浮在1mL培养基内，经适当稀释后，再使之

36、重新形成噬菌斑（图2-133）。再反复进行此操作，直至证实其为纯的噬菌体为止。噬菌斑的形状因噬菌体种类而异，但可归纳为如图2-134所示的几种基本的形状。噬菌斑的大小不等。有的小如针尖，一般称为针孔状噬菌体，有的直径达1015mm，即使是同一种噬菌体，其噬菌斑大小也会因培养基组成和pH值、软琼脂培养基数量和琼脂浓度、菌龄和菌数、平板培养温度和时间等条件的不同而异。即使在同一条件下，其大小也往往不同。总之，在分离噬菌体时，必须注意观察噬菌斑的形状。如按照上述方法，使形状、大小不同的噬菌斑再产生噬菌斑，便可大体了解样品中存在的噬菌体种类。图2-133噬菌斑图2-134噬菌斑的形状白色为溶菌而透明；

37、黑色为细菌生长；无论何种形态，均有边缘清晰与否之分要想知道所分离的是什么噬菌体，可根据其寄主范围，对噬菌体抗性菌的交叉抗性、抗噬菌体血清的交叉中和反应、增殖特性、粒子形态及核酸类型等进行进一步的研究，以判断它们与已保藏的噬菌体的异同。（三）噬菌体保存液的制备和保藏1制备为了制备高效价噬菌体液，可将纯化过的噬菌体加到液体培养基中增殖了的菌液内，培养到发生溶菌为止（有时经长时间培养后会重新变为混浊）。当不能见到溶菌时，可将培养液的离心上清液加到新鲜的培养液中反复进行培养。这样即使不能见到溶菌，噬菌体的效价也很高。当不能得到高效价噬菌体时，可改变培养基、菌液浓度、菌和噬菌体的比例，以及加入噬菌体的时

38、间等，再进行试验。此外，还可在噬菌斑发生重叠的几乎整面都发生了溶菌的平板上加入23mL培养基，用玻璃棒弄碎琼脂层，于37C下放置2090min（也可不弄碎琼脂层，培养35h），使噬菌体游离。在用液体培养法不能得到高效价噬菌体时，可以采用这种方法。2保藏将噬菌体保藏液离心分离后的上清液或过滤液（尽可能纯化了的噬菌体液）在4C密藏，多数可保存颇长时间。若要长期保存，则可加入甘油、血清、脱脂牛奶等分散剂，在冷冻状态保藏（使用超低温冷库等），或经冷冻干燥后保藏。简便的方法是用灭菌滤纸片或琼脂片浸透噬菌体进行保藏。温和噬菌体不能制成保藏液，多以溶原菌形式保藏。五、理化因素对噬菌体的影响噬菌体受理化因素作用后失去感染性，称为灭活（inactivation）。灭活的噬菌体仍保留某些