基因工程第八章克隆基因的表达课件

1、第九章 克隆基因的表达人粒细胞集落刺激因子 Lac启动子遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（central dogma）。 一、基因表达：二、克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中 表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。用原核生物作宿主。A dividing E. coli 第一节 外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点2. 以操纵子为单位1. 只有一种RNA多聚酶有意义链

2、5 反意义链3 转录mRNA5 3 翻译蛋白质NC5 3 3. 转录和翻译偶联、连续进行。4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5. 调控主要在转录水平上。原核生物中起始密码子AUG上游712个核苷酸序列因其与16SrRNA 3末端反向互补而被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6. mRNA具有核糖体结合位点SD序列Shine-Dalgarno（S-D）sequence:二、原核表达系统的注意事项外源基因不能带有内含子。2. 真核生物不能用基因组DNA ，必须用cDNA 。3. 必须利用原核细胞的调控元件（启动子等）4. 防止外源基因产物

3、对宿主细胞的毒害。是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。 三、原核生物基因表达的调控1. 启动子-35 Box 和 -10 Box（1） 启动子序列 consensus sequences5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACA TATAAT 转录起始位点17bp5 核糖体结合位点RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 -35box原核启动子共有序列的相对位置（2）翻译的起始位点核糖体结合位点（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）

4、 sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）位于SD序列下游。ii）起始密码：全酶是一个5聚体，含有两个小亚基，和2两个大亚基（和），一个亚基。 2. RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。（1）结构3. 转录终止子内终止子intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，

5、称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。 原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作 茎环结构 多聚A/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGG

6、CAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠mRNA折叠 U CC U GGCAUCGCGGCCGCGGCA A CCCAC UUUU3 DNARNA聚合酶脱落大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码UAA，UAG，UGA，防止核糖体跳跃（skipping）。4. 翻译终止密码5. 翻译增强子Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR（非翻译区）中富含U的区段。 必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。 应呈

7、现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件 6. 基因工程常用的原核启动子 来自大肠杆菌的乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。PlacO目的基因（2） 乳糖启动子lac阻遏物与操纵基因结合四聚体的阻遏物单体的阻遏物阻遏物与DNA的结合乳糖操纵子控制区的结构阻遏物作用区 CAP作用区 cAMP +CRP= CAPRNA聚合酶作用区组成：长度：205bp的HaeIII片段 （包括-半乳糖苷酶的前8个密码）。环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与C

8、RP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶难以与其结合。 CAP的功能：显著提高酶与启动子结合常数：CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向，以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。 IPTG有毒、昂贵Sigma 636.00元 /

9、gIPTG =异丙基硫代-D半乳糖 人粒细胞集落刺激因子 人粒细胞集落刺激因子 重组大肠杆菌染色体 （3）色氨酸启动子trptrpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2启动子；O操纵基因； 衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。色氨酸操纵子色氨酸合成相关基因5个，编码3种酶。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA邻氨基苯甲 酸合成酶吲哚甘油 硼酸合成酶色氨酸 合成酶链 链 分支酸邻氨基 苯甲酸磷酸核糖基 邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘 油-磷酸色氨酸阻遏物转录（P1是主要启动子，P2的作用只有3%。）没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基

10、因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。苯氨基磷酸脱氧核酮糖 trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸结合不转录用于表达载体的trp启动子一般还附带操纵基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录。 （色氨酸称为corepressor辅阻遏物）（4）PL和PR启动子是从噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高。 cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcIIN:抗终止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）；cI, cII, cII

11、I: 阻遏蛋白； P:启动子；O:操纵子。R:右；L:左cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcII阻遏物转录转录转录当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进PM使cI进一步转录。进入溶原期。 早期左边早期右边cI857:表达载体常用的噬菌体启动子是PL。调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的突变基因cI857。 整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。44-45oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录cI857PL外源基因32oC时阻遏PL，外源基因不转录。四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1. 细胞质中表达（1）包涵体（inclusion body）

12、是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone, hGH）。例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。 缺点 优点2. 周质中表达（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 （3）常

13、用的原核信号肽大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。（2）信号肽（signal peptide）一般位于N端。鼠源RNase、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用。（2）真核信号肽胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；溶血素(hemolysin)是一种可使红血球细胞溶解的毒素(cytolytic toxin)。在许多病原菌被证明与致病相关。 使在大肠杆菌细胞中表达

14、的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。3. 胞外表达或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG优点五、几种类型的原核表达载体1. 非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。（1）pKK223-3 载体组成结构： 强启动子: tac（trp-lac）:trp的-35区lacUV5的-10区lac操纵基因操纵基因：乳糖操纵子系统。终止子：调节基因：Lac I宿主菌染色体上的

15、乳糖操纵子系统。 如JM105菌。rrnB（rRNA操纵子的强终止子）S-D插入位点区S-D序列和插入位点区：tac PLac OS-D插入位点区rrnB T宿主lac I载体的其余部分：来自pBR322质粒。表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物IPTG必须选择一个有lacI的宿主菌。条件：载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pIN III系列： 2. 分泌型表达载体pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）组成结构Ipplac Plac OS-D/ATGompa插入位点Ipp

16、（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。调节基因：lac I S-D序列和起始密码ATG。 分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位点区（多克隆位点）。 强启动子：pIN III-comA1以pBR322为基础构建的。 调节基因不必借助于宿主的lacI.表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。启动子：tac 操纵基因：lacP 调节基因：lacI S-D序列3. 融合蛋白表达载体系统-pGEX系列（1）优点（2）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。lacItac lac OS-D/ATGGST插入位点TGAlacPori：pBR322 ori 融合肽：GST(谷胱

17、甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharose)亲和层析柱分离纯化。（3）产物提纯（4）产物分离用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从谷胱甘肽巯基转移酶GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白凝血酶 外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用pGEX插入区：pGEX-1TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶

18、谷胱甘肽巯基转移酶 CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBamH IXa因子pGEX-2X的插入区：pGEX-3X的插入区：Sma ISma I（5）其他融合蛋白系统His-tag（组

19、氨酸标签）：在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag序列可与带二价正电的阳离子相螯，His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。人胰岛素在大肠杆菌中的表达溴化氰Cyanogen bromide：由于半乳糖苷酶可以和其底物类似物ABTG结合，但不能使之分解，因此可以ABTG为配体进行亲和层析纯化融合蛋白。 5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）六、影响外源基因表达效率的因素1. 启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶 亚基的识别位点（1）一致顺序（2）-35区与-10

20、区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3） -35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACA TATAAT 一致顺序lactrpPL recAtac Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box5-AGGAGGU-3 S-D序列后面的4个碱基： 如果是A（T）, 翻译效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25%。2. 翻译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列？AUG左侧的

21、三个碱基也有影响。 （2）起始密码AUG-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。3. 启动子与外源基因之间的距离转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。4. 转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。选择强启动子序列，如tac 等七、提高表达水平常用的方法2. 调整S-D序列与AUG碱的距离距离过长或过短都影响

22、真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。3. 改变起始密码下面的几组密码子一般为5-9bp。能提高翻译的起始效率。4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到35外切酶的攻击。5. 减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达 一般采用温度诱导或药物诱导。cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。32C:42C:cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。cI857PL外源基因POPL启动子是温度诱导型调节

23、基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。无IPTG:阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。有IPTG:阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。tac启动子是药物诱导型（2）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增加拷贝数。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。温度控制诱导DNA复制的质粒pCI10125C37C10拷贝1000拷贝药物诱导温度诱导ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复

24、制，达到每个细胞的拷贝数10003000个！N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。（1）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物目的基因产物NC切割6. 提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。Z系列载体：ZUV5载体:lac ZGAATTCCTTAAG外源基因Z2载体:lac ZGGGAATTCCCCTTAAG外源基因Z3载体:lac ZGGAATTCCCTTAAG外源基因提供三种融合插入阅读框。使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋

25、白酶。可把pin增加到载体上。（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。（3）表达分泌蛋白 细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。细菌蛋白分泌的条件：位于N端，一般为15-30aa 。真核与原核的结构相似, 功能相似，可以互换。 碱性氨基酸N疏水氨基酸核心区切割位点Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶外源蛋白 有信号肽。 细胞内的转运机制。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达； 但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。信号肽酶I、信号肽酶II等近20多

26、种蛋白质的参与。 蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。 为蛋白指明目的地。八、细菌表达载体举例colE ori lacI intein CBD MCS T7Promotor AmprM13 ori rop 维持拷贝数pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12 几丁质结合区域1. pTYB1，pTYB2: intein在C端pTYB系列E.coli表达载体：内含肽pTYB1, pTYB2的 MCS内含肽2. pTYB11，pTYB12:内含肽intein在N端pTYB11, pTYB12的 MCS内含肽内含肽利用Intein 分离纯化外源蛋白内含肽Intein与Chitin柱结合DTT(二

27、硫苏糖醇)或-巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导内含肽Intein的自我裂解活性3. pTYB系列的特点单柱一步纯化蛋白。无需蛋白酶作用即可将目的蛋白从融合蛋白分离 IPTG诱导的T7启动子分离纯化出天然蛋白，不带有载体蛋白残基。九、外源蛋白质表达后的正确修饰分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1. 形成正确的二硫键 人胰岛素分子抗体分子人血红蛋白分子亚铁血红素如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。2. 前体切割 （1）O-糖基化（Ser, Thr）3. 蛋白质糖基化 糖基（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-Ac

28、Glc：N乙酰氨基葡萄糖甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、软脂化4. 氨基酸残基的修饰 羟脯氨酸甲基组氨酸羟赖氨酸羧基谷氨酸缺乏蛋白质的加工。 （如糖基化、氨基酸修饰等）。十、原核细胞表达的缺陷酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。第二节 外源基因在真核细胞中的表达真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因 能在E.coli中克隆和扩增。1. 酵母克隆载体一、在酵母中表达Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; 有合适的克隆位点。 有酵母的选择标记Ori 有大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。Dividing Saccharomyces cerevis

29、iae (bakers yeast) cells由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段（选择标记）构成。ColE1酵母Leu 2+如 PYeleu10:（1）整合型载体(YIp) 转化率低（110转化子/微克DNA）。特点：载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。不能在酵母细胞中自主复制整合到酵母的染色体上不能从酵母细胞中提取载体。由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。大肠杆菌质粒酵母ARS （2）复制型载体(YRp) 酵母选择标记 ARSARS（automously replicating seq

30、uence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守区特点：转化率高（102-103转化子/微克DNA) 。不稳定，容易丢失。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。穿梭载体（shuttle vector）在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。特点：YRp质粒酵母着丝粒（3）着丝粒质粒(YCp) 不易从细胞中提取。行为像染色体，能稳定遗传。 单拷贝存在。由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒酵母选择标记 2m质粒如pYF92:pBR3222m酵母his 3+（4）附加体型载体(YEp) 2m质粒：酿酒酵母的内源质

31、粒，长度是2m 。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。(1)它们是封闭环状的双链DNA分子，周长约2m(6kb左右)，以高拷贝数存在于酵母细胞中，每个单倍体基因组含60-100个拷贝，约占酵母细胞总DNA的30%； (2)各含约600bp长的一对反向重复顺序； (3)由于反向重复顺序之间的相互重组，使2m质粒 在细胞内以两种异构体(A和B)形式存在。 (4)该质粒只携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因(REP1、REP2、REP3和FLP)，不赋予宿主任何遗传表型，属隐蔽性质粒。2m质粒特点附加体型载体(YEp)特点：很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA

32、）。拷贝数多（25-100拷贝/细胞）。 比YRp稳定。2m oripMB1 oriLeu- 酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、 PEG整合到染色体上， 或独立在酵母细胞内转化Leu营养缺陷型 培养基筛选转化子克隆生长酵母载体大肠杆菌提取插入外源基因鉴定克隆发酵表达外源基因产物分离、纯化2. 酵母转化和表达的一般过程 （1）优点 对其遗传学和生理学的研究比较深入。 小量培养和大规模反应器中都能生长。 已经分离出很强的启动子。 有翻译后的加工。 本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。3. 酵母表达系统的特点 美国食品和药物管理局(

33、Food and Drug Administration)简称FDA 常常发生质粒丢失。 重组蛋白常常超糖基化表达量普遍低。（2）缺点每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖，分泌困难。正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙，诊断试剂丙肝病毒蛋白 抗体HIV-1艾滋病毒外壳蛋白 抗体种类名称疫苗乙肝病毒表面抗原疟原虫环子孢子蛋白HIV-1艾滋病毒外壳蛋白4. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白人类治疗用蛋白药物上皮生长因子胰岛素类胰岛素生长因子血小板源生长因子胰岛素前体成纤维细胞生长因子集落刺激因子1抗胰蛋白酶 凝血因子VIIIa（1）细胞质内表达 例：人Cu/Zn-SO

34、D在酵母中表达：5. 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式超氧化物H+H2O2H2O过氧化物酶表达出的SOD修饰正确：起始氨基酸被切掉， 第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化物歧化酶)宿主： 亮氨酸合成缺陷型酵母。GAPD： 甘油醛磷酸脱氢酶（2）表达分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。 需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法：构建载体在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys(赖氨酸）-Arg（精氨酸）相连。前导肽（leader peptide）：蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来

35、。信号肽的切割：前导肽Lys-Arg重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶6.其它酵母表达系统（1）乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！嗜甲醇酵母（Pichia pastoris）的特点HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1启动子：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。 Aox1启动子和3-aox1：整合到特定染色体的位点序列。表达载体构建（整合型）：诱导物：甲醇。产量： 9106剂疫苗/240L发酵罐。整合到染色体中乙肝表面抗原乙

36、肝表面抗原（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达作为饲料添加剂促进反刍动物消化。产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。乙醇氧化酶基因1乙醇氧化酶基因1二、昆虫培养细胞表达系统1. 杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：两种形式单独病毒粒子形式病毒 粒子宿主细胞病毒 粒子侵染释放病毒 粒子宿主细胞侵染宿主细胞侵染合成多角体蛋白裂解释放多面体溶解一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）多面体形式（2）杆状病毒的

37、表达特点感染后36-48h，病毒开始合成大量的 多角蛋白。多角蛋白的启动子特别强。 多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。3. 转化子筛选通过显微镜检查看是否有多面体形成。源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。2. 最普遍应用的宿主细胞株（1）转移载体的构建大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。4. 杆状病毒转化载体杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。必须使用同源重组的办法。多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。启动子与终止子之间插入多克

38、隆位点转移载体（2）杆状病毒载体转化过程 转移载体中插入外源基因 转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转染宿主细胞 转移载体与病毒基因组发生双交换 外源基因被交换转入病毒基因组中 重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白外源蛋白外源蛋白干扰素腺苷酸脱氢酶干扰素淀粉酶前体蛋白Blue tongue virus中和抗原红细胞生成素HIV-1外壳蛋白流感病毒凝集素白细胞介素2Lassa virus蛋白鼠单克隆抗体脊髓灰质炎病毒蛋白类狂犬病病毒蛋白狂犬病病毒糖蛋白Simian rotavirus外壳蛋白抗原组织型纤溶酶原激活剂5. 杆状病毒大

39、规模表达存在的问题杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。 22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。（1）寿命短感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。（2）共同转染率低重组率更低。0.1%-1%。6. 构建可持续表达的载体利用AcMNPV的一个早期基因IE1的启动子。 IE1基因的转录不依赖于病毒的其他基因产物，而且在昆虫细胞中表达正常。 把外源基因插入到IE1启动子和IE1终止子之间。构成整合型载体。 载体转染宿主细胞后随即整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持续表达。载体IE1启动子外源基因IE1终止子载体三

40、、外源基因在植物中表达根瘤根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时这种质粒会引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤），所以称此质粒为Ti质粒（tumor inducing plasmid）。1. Ti质粒: 环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相当于细菌染色体的3%-5%）。（1）Ti质粒的结构 转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。左边界右边界生长素 基因细胞分裂 素基因冠瘿碱 合成T-DNA（transfer-DNA）生长素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素

41、）的酶iaaM: 色氨酸-2-单加氧酶iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚乙酸细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶, 催化：二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）5-AMPiaaM: 色氨酸-2-单加氧酶章鱼碱（octopine)胭脂碱（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg与丙酮酸缩合成Arg与酮戊二醛缩合成冠瘿碱（opine）的类型和化学结构农杆碱（agropine）冠

42、瘿碱（opine）的作用 冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。Glu 谷氨酸的二环糖衍生物。毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移， 进入和整合。毒性基因（vir）的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIR D2蛋白结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助下穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。单链的3和5端分别是左边界和右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因： 不相容性基因控制

43、Ti质粒的不相容性。冠瘿碱代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。（1）第一步:植物受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。2. 农杆菌的感染和生存（1）第二步 感染植物（3）第三步 毒性基因（vir）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步 T-DNA转移T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步 诱导冠瘿瘤（6）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。乙酰丁香

44、酮、羟基乙酰丁香酮3. Ti质粒的种类根据所编码的冠瘿碱（opine），分为（1）章鱼碱（octopine)型质粒（3）农杆碱（agropine）型质粒（2）胭脂碱（nopaline）型质粒裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。（1）能够自发地整合到植物的染色体上。 （2）能转化多种植物。 （3）强启动子4. Ti质粒转化的对象5. Ti质粒作为载体的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。（1）分子量太大（200kb）！ （2）限制性酶切位点太多。 （3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。 （4）在大肠杆菌中不能复制。6. 天然Ti质

45、粒作载体的缺点（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以 及添加polyA的信号序列。（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因， 左右边界）。 （2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位 点。 （3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植 物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。7. Ti质粒的改造改造后的Ti质粒载体模式leftrightM C SAMProriVirselect8. Ti载体的类型（1）共整合载体（cointegrate vectors）最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等

46、1983年改造的pGV3850需要同源重组才能插入外源基因。 pGV3850的特点：是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。1）农杆菌选择标记2）最终受体植物的选择标记 选择标记卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素对植物有剧毒！） 外源基因插入pGV3850的过程外源基因Kanr pBR322土壤农杆菌 含pGV3850植物组织卡那霉素筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素 的土壤农杆菌外源基因 表达鉴定转化插入感染pBR32

47、2与pGV3850重组整合到 染色体上pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物（2）双元载体（binary vectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（10kb）双元载体的结构Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）双元载体的转化转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。1）基因插

48、入2）帮助质粒（ helper plasmid）Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。左右外源基因双元载体Vir帮助质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源基因感染植物转化左右外源基因进入植物细胞核，整合，表达E.coli（3）三亲融合法(triparental matig)含双元载体的大肠杆菌：含有外源基因和左右边界。含有帮助质粒的辅助细菌：含vir基因。受体农杆菌（空）：三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了外源基因、左右界、和Vir的农杆菌。三亲四、在哺乳动物细胞中表达1.动物细胞基因克隆和表达载体-SV40病毒常用的SV40载

49、体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而来的。 20面体外壳：由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成。5243bp的环状双链。 DNA：（1） SV40病毒的结构SV40猿猴细胞细胞裂解释放SV40啮齿类细胞细胞癌变SV40DNA整合到寄主染色体上受纳细胞非受纳细胞（2）SV40感染和生存方式T-抗原（tumor antigen）:两个6聚体的T抗原结合在SV40 DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。 随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。(3) SV40 DNA的复制解链SV40编

50、码的蛋白。功能是在SV40 DNA复制的时候解开DNA双链。T抗原SV40 DNA双链 SV40 复制起始位点5-CTCACTACTTCTGGAATAGC3-GAGTGATGAAGACCTTATCG120早期回文序列TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTAGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA2147T抗原结合位点GCATAAATAAAAAAAATTAGTCCGTATT TATTTT TTTTAATCAG富含AT区4869早期表达区： (4) SV40病毒的转录和翻译编码大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原。晚期表达区：在DNA复制一段时间后表达，产物是VP1、VP2和