GB4789食品卫生微生物学 副溶血弧菌

1、GB/T4789-2008食品卫生微生物学检验标准 宣贯烟台培训班课件主办单位：中国检验检疫科学研究院综合检测中心食品伙伴网（烟台富美特食品科技有限公司）合作单位：法国生物梅里埃中国有限公司 3M中国有限公司北京陆桥技术有限公司北京祥龙环宇生物技术有限公司食品卫生微生物学检验副溶血 性弧菌检验Microbiological examination of food hygieneExamination of Vibrio Parahaemolyticus GB/T4789.7-2008盛长江2009.5.23概述副溶血性弧菌属弧菌科，是一种生活在近海的海洋 微生物，深海一般未发现，大多在温暖的季

2、节水体 中分离到该菌。从多种海产品中均能分离到该菌。副溶血性弧菌引发的胃肠炎一般表现为骤发性剧烈 腹痛。所有的副溶血性弧菌胃肠炎起因均是由于进 食了海产品或海产品相关的一些食物。在日本，有 副溶血型弧菌引发的胃肠炎相当普遍，约占全部胃 肠炎爆发事件的50%，原因是日本人爱生吃鱼。概述海洋环境中副溶血性弧菌的浓度通常为102CFU/mL 或更低。而该菌引发的胃肠炎仅在摄入大量细菌（106CFU）时才会发生。因此，只有在食品处理方法不当导致细菌大量繁殖时，如生吃污染严重的滤 食性海鲜食品，或进食未经恰当烹饪处理的污染食 品时，才会引起胃肠炎。概述副溶血性弧菌为条件致病菌，感染的伤口中曾分离到 该菌

3、，尤其是在洗浴者和海产加工工人的伤口中。虽然副溶血性弧菌与肉及肉制品关联不大，但在腌肉 制品中曾分离到其他的嗜盐弧菌（肋生弧菌和其他未 分型弧菌），并且确定为引发变质的微生物。由于副 溶血性弧菌存在于海鲜食品中，随着鱼肉来源的食品 添加物质如鱼糜等在肉制品中应用越来越多，未来由 副溶血性弧菌引发的问题将不容忽视。生物学特性-菌体形态及染色特性革兰氏染色阴性；菌体呈直或弯曲杆状；单极鞭毛具动力，有时在固体培养基中生长后 可产生周生鞭毛。生物学特性-培养特性及生化反应兼性厌氧；具发酵性和氧化性代谢；氧化酶阳性；能将硝酸盐还原成亚硝酸盐；40下能生长；培养基中氯化钠浓度至少必须在1%以上才能 生长，

4、最适浓度为3%6%。本标准修改采用了美国食品药品管理局（FDA）细菌 学分析手册第9章：霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧 菌和其他弧菌(Bacteriological Analytical Manual, chapter9：Vibrio cholerae, V.parahaemolyticus, V.vulnificus and other vibrio spp.)。本标准与FDA方法相比主要区别如下：将样品制备时取样量50g(mL)修改为25g(mL)；将增菌时间16h18h修改为8h18h；增加科玛嘉弧菌选择性平板；增加全自动细菌生化鉴定仪VITEK；抗原表中增加了新的血清型。副溶血性弧菌检

5、测流程（ GB/T 4789.72008 ）本标准代替GB/T 4789.7-2003食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验。本标准自实施之日起，GB/T 4789.7- 2003同时废止。本标准与GB/T4789.7一2003相比主要变化如下：将选择性增菌液由氯化钠结晶紫增菌液改为3%氯化钠 碱性蛋白胨水；将选择性分离培养基由氯化钠蔗糖琼脂和嗜盐菌选择性琼脂改为硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂和科玛嘉弧 菌显色培养基；增加API 2OE诊断试剂条及全自动细菌生化鉴定仪VITEK；增加血清学分型；将动物试验改为神奈川试验；增加最可能数检索表。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华

6、人民共和国卫生部提出并归口。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心营 养与食品安全所。本标准参加起草单位：福建省疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研 究院、北京市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：刘秀梅、陈艳、马群飞、程 苏云、陈彦长、陈倩。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB 4789.7-1984，GB/T 4789.7-1994， GB/T 4789.7-2003.范围本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahamolyticus）的检验方法。本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。食品卫生微生物学检验 副

7、溶血性弧菌检验（ GB/T 4789.72008 ）设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。2.1 恒温培养箱：36士1。2.2 冰箱：25。2.3 均质器或无菌乳钵。2.4 天平：感量0.1g。2.5 无菌试管：18mm18Omm，15mm100mm2.6 无菌吸管： l mL（具0.01mL刻度），l0mL（具0.lmL刻 度）或微量移液器及吸头。2.7 无菌锥形瓶：500mL，250mL。2.8 无菌培养皿：直径90mm。2.9 全自动微生物鉴定系统（VITEK）。2.10 无菌手术剪、镊子。培养基和试剂3.1 3%氯化钠碱性蛋白陈水（APW）3.2 硫代硫酸盐

8、柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂3.3 3%氯化钠胰蛋白陈大豆（TSA）琼脂3.4 3%氯化钠三糖铁（TSI）琼脂3.5 嗜盐性试验培养基3.6 3%氯化钠甘露醇试验培养基3.7 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基3.8 3%氯化钠MRVP培养基3.9 我妻氏血琼脂3.10 氧化酶试剂3.11 革兰氏染色液3.12 ONPG试剂3.13 VogesProskauer（VP）试剂3.14 科玛嘉（CHROMagar）弧菌显色培养基。3.15 API 2OE生化鉴定试剂盒或VITEK NFC生化鉴定卡。检测流程（ GB/T 4789.72008 ）361 8h18h样品25g（mL）+225mL 3

9、%氯化钠碱性蛋白胨水3%氯化钠碱性蛋白胨水3管3个合适的梯度 如果进行定性试验，则不需要此步骤挑取可疑菌落，接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂361 18h24h361 18h24h硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂或科玛嘉弧菌显色培养基划线分离筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色， 3%氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验生化试验或选用API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK结果报告血清学试验、神奈川试验检测流程（ SN 0173-92 ）样品50g450mL 30g/L氯化钠稀释液60g/L氯化钠蛋白胨水33管氯化钠多粘菌素B肉汤33管氯化钠多粘菌素B肉汤硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐蔗糖琼脂平板无盐胰胨水

10、30g/L氯化钠胰胨水氯化钠三糖铁琼脂革兰氏染色镜检70g/L 氯 化 钠 胰 胨 水细 胞 色 素 氧 化 酶 试验100g/L 氯 化 钠 胰 胨 水靛 基 质 试 验赖 氨 酸 脱 羧 酶 试 验V-P试 验精 氨 酸 双 水 解 酶 试验均质（8000r/min）,1min操作步骤样品制备冷冻样品应在45以下不超过45min，或在25不超过 18h解冻，若不能及时检验，应放于-15左右保存；非冷冻而 易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置25 冰箱保存，在24h内检验。鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部 分

11、，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中 冲洗外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳。以无菌操作取样25g（mL）加入3%氯化钠碱性蛋白胨水 225mL，用旋转刀片式匀质器以8000rpm匀质1min，然后放在 500mL的灭菌容器内，加225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。增菌定性检测将上述1:10稀释液于36土l培养8h18h。定量检测用灭菌吸管吸取1：10稀释液ImL，注入含有9mL3%氯化钠 碱性蛋白陈水的试管内，振摇试管混匀，制备1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释 液，每递增稀释一次，换用一支l mL灭菌吸管。根据对检样污

12、染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度， 每个稀释度接种三支含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试 管，每管接种lmL。置36土l恒温箱内，培养8h18h。分离在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环， 于TCBS平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离。 一支试管划线一块平板，于36土1培养18h24h。典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直 径2mm3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不 超过l h）挑取菌落或标记，要挑取的菌落。典型的副溶血 性弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面 光滑的粉紫色菌落，直

13、径2mml3mm。纯培养挑取三个或以上可疑菌落，划线3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼 脂平板，36士1培养18h24h。初步鉴定氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副 溶血性弧菌为氧化酶阳性。涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状 等多形态，无芽胞，有鞭毛。氧化酶试验：阳性初步鉴定挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖 铁琼脂斜面并穿刺底层，36士1培养24h观察结 果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反 应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红 色加深，有动力。初步鉴定嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可 疑菌落，

14、分别接种于不同氯化钠浓度 的胰胨水，36士1培养24h，观 察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无 氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生 长或微弱生长，在7%氯化钠的胰胨 水中生长旺盛。确定鉴定生化试验：取纯培养物分别接种含3%氯化钠的甘露 醇、赖氨酸、MR-VP培养基，36士1培养 24h48h后观察结果。隔夜培养物进行ONPG试验。API 2OE生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取3%氯化钠 胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制 备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API 20E生化鉴定 试剂盒或VITEK鉴定。甘露醇：阳性 右侧为阴性对照MR：阳性（红色） 左侧为阴性对照VP：阴性左起依次为：对

15、照，精氨酸（-）， 赖氨酸（+），鸟氨酸（+）靛基质： 阴性（左）VITEK32API 20E报告当检出的可疑菌落生化性状符合表1要求时，报告 25g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量 检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查 最可能数（MPN）检索表，报告每克（毫升）副溶血 性弧菌的MPN值。试验项目结果革兰氏染色镜检阴性，无芽孢氧化酶动力蔗糖葡萄糖甘露醇分解葡萄糖产气乳糖硫化氢赖氨酸脱羧酶VPONPG注：阳性；阴性表1副溶血性弧菌的生化性状名称氧 化 酶赖 氨 酸精 氨 酸鸟 氨 酸明 胶脲 酶V- P42 生 长蔗 糖D纤 维 二 糖乳 糖阿 拉 伯 糖D-甘 露 糖D-

16、甘 露 醇O N P G嗜盐性试验 氯化钠含量/%036810副溶 血性 弧菌+-+V-+-V-+-+-创伤 弧菌+-+-+-+-+V+-+-溶藻 弧菌+-+-+-+-+霍乱 弧菌+-+-V+-+-拟态 弧菌+-+-+-+-表2副溶血性弧菌的主要性状与其它弧菌的鉴别名称氧 化 酶赖 氨 酸精 氨 酸鸟 氨 酸明 胶脲 酶V- P42 生 长蔗 糖D纤 维 二 糖乳 糖阿 拉 伯 糖D-甘 露 糖D-甘 露 醇O N P G嗜盐性试验 氯化钠含量/%036810河 弧菌+-+-+-V+-+-+V-弗氏 弧菌+-+-+-+-+-+-梅氏 弧菌-+-+-+V+-+-+V-霍利 斯弧菌+-nd-+-+

17、-注：nd表示未试验；V表示可变血清学分型（可选择）制备：接种两管3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面， 361 培养18h24h。用含3%氯化钠的5%甘油溶液 冲洗3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面培养物，获得浓 厚的菌悬液。K抗原的鉴定：取一管上述制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清进行检测，出现凝集反应时再用单个的抗血清进行检 测。用蜡笔在一张玻片上画出适当数量的间隔。在每个间隔 内各滴加一滴菌悬液，并加一滴相当的K血清。在对照间隔 内加一滴3%氯化钠溶液。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，在前后倾动玻片1分钟。阳性凝集反应应可 以立即观察到。O抗原的鉴定：将另外一管的菌悬液转移到离心管内，12

18、1灭菌1h。灭菌后4000rpm离心15min，弃去上 层液体，将细胞浆弹起制成上层清液。用蜡笔将玻片划 分成相等的间隔。在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分别加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐 水作自凝对照。轻微倾斜玻片，使各成分相混和，在前 后倾动玻片1min。阳性凝集反应应可立即观察到。如果 未见O群血清的凝集反应，将菌悬液121再次高压1h后 重新检测。如仍旧为阴性则培养物的O抗原属于未知。根据下表报告血清学分型结果。O群K型11，5，20，25，32，38，41，56，58，60，64，6923，2834，5，6，7，25，29，30，31，33，37，43，45，48，54，56，57，58，59，72，7544，8，9，10，11，12，13，34，42，4