叶绿素实验报告

1、叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定食品092一、实验目的：1、从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率。2、初步研究叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件。3、分析叶绿素铜钠产品的纯度并计算其产率。4、通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。二、产品验收指标项目和指标1项目1指标11 pH | 9.010.7 1% |E 405nm N | 1cm |568消光比值| 3.24.0总铜(Cu),% |4.06.0游离铜(Cu), %W | 0.025砷(As), % W | 0.0002铅(Pb), % W |0.0005干燥失重，% W| 4.0硫酸灰分,% W| 36.0 1三、实验原理：叶绿素是一

2、种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的绿叶 和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必须的催化剂，叶绿素难溶于水，而易溶 于极性有机溶剂。叶绿素有a和b两种，a为蓝黑色结晶叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个 毗咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环.卟吩环闭合的共轭体系提供了包围 镁离子(或其它相似离子)的刚性平面.叶绿素的结构如图l所示：叶绿素H”叶绿素b叶绿醇基JYtCHO r矿叶绿醇基.蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.81.0%，居所有天然色素之首， 故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂， 故可用乙醇、丙酮混合液

3、来提取。所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解， 且又不溶于水。110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳 定溶解性也会有所提高。叶绿素分子中的镁原子和四个毗咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯， 一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：C H ONMg + 2NaOH = C H ONMgNa + CH OH + C5572543430542320H OH3C H O N Mg + 2NaOH = C H O N MgNa + CH OH + C5570643428642320H OHC H ONMgNa + 4HC34H30O5N4MgNa2 +

4、 4H叶绿酸可与铜盐在加2热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙 酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：C H O N CC34H32O5N4C4C3430542C H ONCuNa + 2H O蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在360700之间+=CHON +Mg2+2Na +=C34H34O5N4+Mg2+2Na +CHON +Cu2+=。34工4。卜4+52,二C H ONCu+ 2NaOH =c34h：O：n4cu+ 2NaOH =3蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性U +H302H +2H +O5NCuNa + 2H O39在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿 酸：有2个吸

5、收峰在波长440处有一最大吸收峰，其吸光度为114;在630处有一较小的 吸收峰，其吸光度为017在波长440的吸收峰为叶绿素铜钠盐特有，而在630处的 吸收峰为叶绿素特有，叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍，所以试 验中均采用440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。下图是蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性。1、蚕沙（50克）42、祥御 4必、轴母溶 白由稀盐酸5、丙酮 6、石油醚7、CUSO4溶液4 r|44 8、蒸馏水9、40%乙醇（纯乙醇与蒸馏水按2:3配）10、5%N：OH-乙醇溶液11、pH试纸 12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）.取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以

6、21： 4混合（二）、仪器：I .，.一：-A、叶绿素的提取叶绿素铜钠合成1、 温度计1支回流冷凝管1支 500ml圆底烧瓶1个恒温槽1台滤瓶及漏斗1个 胶头胶管1个玻璃棒1支100mL量筒1个 铁架台1台电热恒温水浴装置1套2、 减压蒸馏装置1台3、台氏天平1台4、PH试纸若干B、叶绿素铜钠质量分析1、751分光光度计1台2、 台式天平、分析天平各1台3、 玻棒1支 胶头滴管1支 10mL、50mL量筒各一个 100mL、50mL容量 瓶各1个25mL、1mL吸量管各一支4、试纸若干吸耳球一个五、实验步骤（一）叶绿素铜钠的合成1、叶绿素的提取：（1）在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙

7、，再加入95%乙醇100ml。（2）将反应瓶用水浴加热，使水浴温度在60C（防止叶绿素a和b分解），浸 泡提取2小时，滤出提取液。（3）按步骤2用乙醇重复2次。（4）合并3次提取液，在减压、不超过60摄氏度下蒸出乙醇。趁热倾出瓶中液 体，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置）。2、皂化:将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用5%NaOH-C H OH溶液调节使其pH=11，用2 5水浴加热在60C下皂化回流1小时。3、萃取：将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质（黄色）静置分 层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取上层液检验是否完全皂化：取上层液少 许置于小烧杯中，加入2

8、3倍石油醚静置，用玻棒沾取上层液去试纸上，呈绿色 则不完全皂化。取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。平行萃取 3次。4、调酸铜代：将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH=7后，加 入10%的硫酸铜10ml，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，在水浴60 C 下保温搅拌1小时。趁热过滤，用95%乙醇洗涤3次后抽干。合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水， 析出叶绿素铜，静置过夜后过滤，滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+、C7及残留的叶黄素和其他有机杂质。5、成盐:洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH

9、-乙醇溶液，调节pH=11， 搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不 显绿色则说明完全成盐），将其在60C下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物， 然后再在60C下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。流程图：溶剂NaOH溶液不皂化物溶剂 酸CuSO4溶液 滤渣!t !蚕砂 一|预处理|浸提| 皂化| |分离| |萃取卜调pH值卜铜化| 过滤一水稀酒精NaOH!一离析一沉淀一纯化一成盐一过滤一干燥一成品（二）、纯度分析：1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶 中，加水至刻度，摇匀。准

10、确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇 匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比色杯，在405nm 波长处测定吸光值（A）,以缓冲液作空白对照。类似地配制0.0005%溶液、0.0015% 溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比 色杯，在405nm波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标 准曲线。2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中， 加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100

11、mL，摇匀， 即为0.001%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm， 吸光比入405顷/土加为 3.24.0。用分光光度计测定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶 液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定称取烘干成品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中， 加水至刻度，摇匀。从容量瓶中准确取2mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸 盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0. 004%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm。 用分光光度计测定，用1cm的比色杯

12、，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。六、实验现象试验操作试验现象备注称取蚕沙50g墨绿色加入去离子水浸润和95%乙醇 60C搅拌回流2h蚕沙部分溶解抽滤，保存滤液得到呈墨绿色的液体剩余蚕沙用95%乙醇再次回流2 次抽滤，混合三份滤液得到呈墨绿色的液体提高产率水浴，减压蒸馏，把合并滤液放 入旋转蒸发仪，并在55C水浴中 加热蒸馏回收95%乙醇得约50mL左右溶液，溶液 成糊状，蒸发液呈无色防止污染 循环利用在浓缩液中加5% NaOH-乙醇调 PH值到11，在温度为60C， 皂化时为1h溶液出现小气泡皂化过程皂化后

13、，并洗涤加HCl调，PH = 7 加入 10%CuSO 调 PH = 2- 3，在 搅拌下温度60C，保持1h左右PH试纸变红色此时慢慢出 现胶状墨色悬浮物叶绿素铜酸趁热过滤，滤渣先用水洗去，再 用95%乙醇洗涤3次后抽干。合 并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏 水，静置过夜后过滤得墨绿色物质洗涤液呈绿色固体溶解得绿色液体得墨绿色粉末叶绿素铜钠滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇 及石油醚洗涤3次，放进烘箱中 烘干石油醚层变为浅绿色以除去其中 的H+ Cl及残 留的叶黄素和 其他有机杂质。称取0.010g叶绿素铜钠溶于蒸 馏水配成0.1%溶液，再稀释25 倍，测其pH值除去水分得墨绿色结晶物略有胺味 结

14、晶物0.0483g七、实验数据与处理一、标准叶绿素铜钠盐标准曲线标准曲线的测定方法：取标准样品配制0.1%叶绿素铜钠盐溶液，用移液管 分别精确量取 2.5 mL； 2.0mL； 1.5mL； 1.2mL； 1.0mL； 0.5mL 移至 5 个加入 100mL 的容量瓶中，向其中各加入pH=7.5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，摇匀定容至 刻度，即 0.0025%； 0.002%； 0.0015%； 0.001%； 0.0005%。以缓冲液作空白对 照，分别测以上溶液在波长405nm下的吸光度值A405。如表1、图1所示。表1叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm）405溶

15、液百分数（%）0.2000.00050. 0010. 00150. 0020.0025溶液仃分合员0. 0030.00050.1980.0010.3620.00150.5520.0020.7160.00250.924二、叶绿素铜钠盐的吸收曲线（一）标准样品：取标准样品配制0.001%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm的 比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一 次），以缓冲液作空白对照。测定数据如表2所示，吸收曲线如图2所示。表2标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表波长 /nm350355360365370375380385390吸光度

16、0.1420.1500.1570.1660.1770.1970.2170.2590.292波长 /nm395400405410415420425430435吸光度0.3270.3570.3790.3770.3380.2720.2130.1690.139波长 /nm440445450455460465470475480吸光度0.1190.1040.0920.0830.0740.0670.0600.0550.050波长 /nm485490495500505510515520525吸光度0.0470.0440.0420.0410.0400.0390.0380.0370.037波长 /nm530535

17、540545550555560565570吸光度0.0380.0390.0390.0390.0390.0370.0360.0400.043波长 /nm575580585590595600605610615吸光度0.0400.0420.0430.0430.0430.0410.0430.0460.052波长 /nm620625630635640645650655660吸光度0.0590.0670.0710.0690.0640.0570.0490.0440.039波长 /nm665670675680685690695700吸光度0.0350.0320.0290.0260.0240.0210.0190

18、.017I冬12标准川绿素铜钠吸收曲线3（二）产品：I 10 则 5 心 5906 106907 10取产品配制0.004%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用icm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照。测定数据如表3所示，吸收曲线如图3所示。数据记录：1、产品的质量是0.0483g （借第12组：冯奕淇和雷春雨的实验结果）2、产品产率:W=0.0483/50*100%=0.0966%3、吸光比二A410nm/A630nm=0.065/0.037=1.8表3产品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表波长 /nm3503603

19、70380390400410420430吸光度0.0680.0640.0600.0580.0610.0620.0650.0640.057波长 /nm440450460470480490500510520吸光度0.0510.0470.0430.0390.0380.0360.0350.0330.034波长 /nm530540550560570580590600610吸光度0.0340.0340.0330.0330.0320.0330.0350.0350.035波长 /nm620630640650660670680690700吸光度0.0350.0370.0370.0350.0360.0350.03

20、80.0370.035图3叶绿素曲线63)螯果诲有完全烘干，实际用于配制溶液的产品的质量小于称量的质量。配制溶液的 原因：由于产品纯度较低，所以相应的用于配制溶液的产品的质量也应该增多，而 配的溶液的含量较小，这可能就造成了所测得的吸光度较小的原因。实验失败的原因：1、蚕沙不过粉碎，可能导致叶绿素溶解不过充分，加乙醇回流时，时间2小时 每次，因浸提不充分，浸提时间不够会导致提取率过低。2、皂化1小时后，用石油醚萃取，上层杂质还是绿色，可能是皂化时间不够， 这步导致了大量叶绿素的流失，以致最终产率只有微量而无法配置叶绿素溶液测 吸光度。3、整个实验过程中洗涤与过滤次数较多，而叶绿素盐粘稠易粘附在滤纸上，很 不容易取下，且在洗涤过程也有叶绿素盐的损失。以上两项操作直接影响到产率 的高低。4、调酸铜代这步时，由于保温后趁热过滤时过滤速度比较慢，还没过滤完就用 95%的乙醇边洗涤变过滤，乙醇作用