叶绿素a分光光度法

1、分光光度法检测叶绿素a叶绿素是植物光合作用中的重要色素。通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水 体的初级生产力情况。在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化的指 标之一。一、水样的采集和保存可根据工作需要进行分层采样。湖泊、水库采样500ml，池塘300ml，采样 量视浮游植物分布量而定，若浮游植物数量较少，也可采样1000ml。采样点及 采样时间同浮游植物的采样或按需要进行。水样采集后应放阴凉处，避免日光直射。最好立即进行测定的预处理，如需 经过一段时间（4-48h）方可进行预处理，则应将水样保存在低温（04C ）避光 处。在每升水样中加入1%碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。预处

2、理 后的水样在冰冻情况下（-20C ）最长可保存30d。二、仪器与试剂仪器1）分光光度计2）真空泵3）离心机4）乙酸纤维薄膜（孔径0.45 Mm）5）抽滤器6）刻度离心管（10ml）试剂1）1%碳酸镁溶液：称取1.0g细粉末碳酸镁（MgCO3）悬浮于100mL蒸馏水中。 每次使用时要充分摇匀2）90%丙酮：丙酮和蒸馏水按照9:1混合，每次实验前现配现用（否则会出现 悬浮物）。三、实验流程1）以离心或过滤浓缩水样。在抽滤器上贴好乙酸纤维薄膜，用少量水将其 湿润以便将薄膜固定在抽滤器上，倒入定量体积的水样（湖泊水样一般为500ml） 进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50kPa），水样接近抽滤完成

3、时，在抽滤 器的水样中滴入1-2滴1%碳酸镁悬浊液，水样抽完后继续保持一段时间，以减少 滤膜上的水分，放入4。冰箱干燥24小时供下一步使用。如需长期保存（30d）， 则应放入低温冰箱（-20C ）保存。2）取出低温干燥后的带有浮游植物的滤膜，用90%丙酮定容到10ml，进行 叶绿素萃取，静置20min，摇匀，使带有浮游植物的滤膜均匀溶解，用离心机（30004000r/min）离心 10min。3）以90%丙酮作为空白吸光度测定，放入1cm光程的比色皿中对样品吸光 度进行校正。取样品上清液，放入1cm光程的比色皿中，分别读取750nm、663nm、 465nm、630nm波长的吸光度，对叶绿素a

4、含量进行测定。四、计算方法叶绿素 a=（11.64x（D663-D750）-2.16x（D645-D750）+0.10 x（D630-D750）xV1Vx6水样体积（L）；D吸光度；提取液定容后的体积（ml）6比色皿光程（cm）。五、实验原理叶绿素a在645nm和663nm处均有吸收，在645nm处吸光系数较小，为 16.75,在663nm处较大，为82.04；叶绿素b在645nm和663nm处亦都有吸收， 但与叶绿素a相反，在645nm处吸光系数较大，为45.60，在663nm处较小， 为9.27。由此可知：叶绿素a的吸收峰值出现在663nm处，该吸收曲线延伸到645nm处，在此波长处的吸收

5、系数不如在663nm处大，因此在计算公式中求算 叶绿素a的含量时，需扣除叶绿素b在645nm处的吸光度值，再进行计算。此外有一部分叶绿素a会与镁离子结合形成叶绿素镁，在630nm波长处有 吸收，也属于叶绿素a含量，应计算在内。在750nm波长下测量吸光度目的是避免悬浮物质的干扰，一般测量水中的 浑浊度所采用的波长为680nm，为避免在680nm处仍有叶绿素a产生的吸收值， 故将测量浑浊度的波长选在710nm以上。在计算公式中，凡参与计算的各吸光 度值都应减去750nm处的吸光度值，以扣除悬浮物质的干扰，其值应小于叶绿 素a吸收峰的吸光度值的5%，否则应重新过滤。标准分析方法要求，叶绿体色 素提取液不能是浑浊状态，假定样品在663nm处的吸光度值为0.03,则在750nm 处的吸光度值不得大于0.001