生物工艺学第七章生物反应器和生物工艺过程的放大

1、生 物 工 艺 学第七章生物反应器和生物工艺过程的放大7.1 概述 7.2 生物反应器 7.2.1 生物反应器的分类 7.2.2 深层液态反应器 7.2.3 固态发酵反应器实验室试验研究7.3.1 实验室的生物反应器 7.3.2 摇瓶试验 7.3.3 实验室研究和实验设计方法生物反应过程放大实验室摇瓶与发酵罐培养的差异 7.4.2 发酵罐规模改变的影响 7.4.3 生物工艺过程放大的方法 7.1 概述生物工程技术的最终目标是为人类提供服务，创造社会和经济效益。因此，生物产品必须经历从实验室到规模化生产直至成为商品的一系列过程，其研究开发过程包含了实验室的小试，适当规模的中试和产业规模化生产等几

2、个阶段。 实验室小试适当规模的中试产业规模化生产 7.2 生物反应器生物反应器是利用生物催化剂(游离态或固定态的微生物或动、植物细胞及酶)进行生物技术产品生产的反应装置称为生物反应器或生化反应器，常称为发酵罐。 7.2.1 生物反应器的分类 根据所使用的生物催化剂种类的不同可将生物反应器分为酶生物反应器和细胞生物反应器，其中细胞生物反应器又可分为微生物细胞生物反应器及动物细胞生物反应器、植物细胞生物反应器、微藻生物反应器。 根据生物催化剂的使用形式可分为固定化酶或细胞的反应器及游离态酶或细胞的反应器。其中常见的酶、细胞的反应器具体有搅拌罐式、固定床或填充床、流化床、膜式反应器、鼓泡塔式反应器等

3、。 根据培养过程中是否需要光照，分为光照生物反应器和普通生物反应器。 7.2.1 生物反应器的分类 根据生物反应器的几何形状(高径比或长径比)和结构特征来分类，可将反应器可分为罐式(槽式或釜式)、管式、塔式及膜式等几大类。罐式反应器的高径比较小，一般为13，常含有搅拌器。 根据培养基状态分为固态生物反应器及液态生物反应器。对于大多数的生物反应都是采用深层液态发酵方式，但仍有一部分研究及应用采用固态发酵方式 。根据操作方式不同可分为分批(间歇)式、分批补料式、连续式。连续式操作时采用多级罐式反应器串联使用。7.2.1 生物反应器的分类 根据微生物细胞对氧的需求与否，分为好氧型生物反应器和厌氧型生

4、物反应器。好氧型生物反应器，又称通气生物反应器，根据通入空气及物料混合的方式不同，可分为搅拌式、气升式、自吸式反应器。 大多数的生化反应都是采用的深层液态发酵法 。 它具有如下优点：液体悬浮状态是许多微生物的最适生长环境。在液态环境中，菌体、底物，产物(包括热) 易于扩散，使发酵在均质或拟均质条件下进行，便于检测、控制，易扩大生产规模。液体输送方便，易于机械化、自动化操作。产品易于提取精制。 常见的好氧深层液态反应器有机械搅拌通风反应器、气升式反应器、自吸式反应器等。7.2.2 深层液态反应器7.2.2.1 机械搅拌通风反应器 机械搅拌通风反应器 ，是工业上最常用的一种微生物反应器。这类发酵罐

5、既具有机械搅拌又有压缩空气分布装置。搅拌器的主要作用是打碎空气气泡，增加气液接触界面，以提高气液间的传质速率，同时也是为了使发酵液充分混合，液体中的固形物料保持悬浮状态。 机械搅拌通风发酵罐主要部件有：罐体、搅拌器和挡板、消泡器、联轴器及轴承、变速装置、空气分布装置、轴封、冷却换热装置等。机械搅拌通风反应器结构图 机械搅拌通风反应器机械搅拌通风发酵罐的结构及几何尺寸通用式发酵罐的几何尺寸比例H/D=1.73d/D=1/21/3W/D=1/81/12s:两搅拌器间距,W:挡板宽度d:搅拌器直径,H:发酵罐筒身高HL:液位高度,B:下搅拌器距底间距,D:发酵罐内径机械搅拌通风反应器的搅拌器反应器的

6、搅拌器使被搅拌的液体产生轴向流动和径向流动。其作用为混合和传质，它使通入的空气破碎分散成气泡，增大气液界面，与发酵液充分混合，获得所需的溶氧速率，并使细胞悬浮分散于发酵体系中，以维持适当的气液固(细胞)三相的混合与质量传递，同时强化传热过程 。搅拌器分为轴向式（桨叶式、螺旋桨式）和径向式（平叶式、弯叶式、箭叶式）两种。搅拌叶轮大多采用涡轮式，最常用的有平叶式、弯叶式圆盘涡轮式搅拌器，叶片数量一般为6个。 搅拌叶类型 圆盘平直叶涡轮搅拌器 圆盘箭叶涡轮搅拌器 圆盘弯叶涡轮搅拌器 桨叶式搅拌器 螺旋桨式搅拌器 在相同的搅拌功率下粉碎气泡的能力的大小是，平叶搅拌器大于弯叶搅拌器，弯叶搅拌器大于箭叶式

7、搅拌器；但其翻动流体的能力则与上述情况相反。 在反应器中加设挡板是为了防止液面中央形成漩涡流动，增强其湍流和溶氧传质。挡板的高度自罐底起至设计的液面高度止。机械搅拌通风反应器的挡板 全挡板条件是在搅拌发酵罐中增加挡板或其他附件时，搅拌功率不再增加，而旋涡基本消失。搅拌器的形状和安装位置决定其在发酵罐内的运行的性能。经验表明，发酵罐中如采用列管式换热器也可起到挡板的作用。反应器中的换热装置机械搅拌通风反应器的换热装置罐内换热罐外换热小型发酵罐多采用外夹套传热装置 大中型发酵罐多采用排管传热装置夹套传热排管传热 搅拌器分为轴向式（桨叶式、螺旋桨式）和径向式（平叶式、弯叶式、箭叶式）两种。机械搅拌通

8、风反应器的搅拌器 其作用为混合和传质，它使通入的空气破碎分散成气泡，增大气液界面，与发酵液充分混合，获得所需的溶氧速率，并使细胞悬浮分散于发酵体系中，以维持适当的气液固(细胞)三相的混合与质量传递，同时强化传热过程 。 反应器的搅拌器使被搅拌的液体产生轴向流动和径向流动 机械搅拌反应器 优点:操作弹性大，pH值和温度易于控制；有较规范的工业放大方法；适合连续培养。 缺点:驱动功率大；内部结构复杂，难于彻底洗净,易造成污染；在丝状菌的培养中由于搅拌器的剪切作用，细胞易损伤。 气升式反应器也是目前应用较为广泛的生化反应设备，这是一类塔式反应器，高径比较大，其中相际的混合与传质是借各种方式诱导的环流

9、来实现的。气升式反应器 常见类型有气升环流式、鼓泡式、空气喷射式 具有结构简单、不易染菌、溶氧效率高、剪切力小、传热良好、能耗低等优点。7.2.2.3 自吸式反应器 自吸式反应器不需空气压缩机供应压缩空气，而是利用搅拌器旋转时产生的抽吸力吸入空气。搅拌器是一空心叶轮，叶轮快速旋转时液体被甩出，在叶轮中心形成负压,从而将罐外空气吸到罐内。自吸式反应器 优点:利用机械搅拌的抽吸作用将空气自吸入反应器内,达到既通风有搅拌的目的，从而省去了压缩机。 缺点:吸程一般不高，必须采用低阻力高效空气除菌装置。 7.2.3 固态发酵反应器培养基组成较简单培养基含水量低，后处理加工较方便不一定需要连续通风产物的产

10、量较高设备简单、投资小、能耗低 固态发酵过程虽然不如深层液态发酵普遍，但固体发酵也具有很多液体发酵所不具备的优点，主要表现为：浅盘式反应器填充床反应器转鼓式反应器 固态发酵反应器的类型浅盘式反应器 浅盘式反应器很早地应用于抗生素、有机酸的固态表面培养的生产中 。通常由木质、塑料、或金属的材质制成的、带盖或无盖的、底部能通风的浅盘。 浅盘式反应器属于静态反应器，浅盘式的结构和操作都相对简单，装料量少，要实现大规模生产，可增加浅盘数目。浅盘室内的温度和湿度容易控制，特别适用于制曲。这种反应器由于存在对流空气，散热效果较差，对浅盘物料的厚度有所限制，并且占地面积较大，需要耗费一定的人力。浅盘固态发酵

11、反应器7.2.3.2 填充床反应器 填充床反应器中的固体物通常呈颗粒状，粒径为215mm左右，堆积成一定高度(或厚度)的床层，床层静止不动，在床层底部通常装有强制通风装置，可满足较大量的固态培养基的发酵需求 。 填充床反应器是目前机械化程度较高的能实现固态发酵的反应器，主要用于米曲、麸曲的工业化制备。 7.2.3.3 转鼓式反应器转鼓式反应器的基本形式是一个圆柱型或鼓型容器支架在一个转动系统上，转动系统主要起支撑和提供动力的作用。转鼓反应器包括基质床层、气相流动空间和转鼓壁等组成的多相反应系统。与传统固态发酵生物反应器不同的是：基质床层不是铺成平面，而是由处于滚动状态的固体培养基颗粒构成。菌体

12、生长在固体颗粒表面，转鼓以较低的转速转动，就如同设置了搅拌轴那样加速传质和传热过程。 实验室的研究内容主要为新产品开发的理论研究，新发酵菌种的选育、筛选、新发酵原料的开发、培养基配方及培养条件的优化、新工艺及技术的研究及放大等。 实验室中小规模的研究，常要用到各种型号的试管、培养皿、三角瓶等玻璃器皿。试管、培养皿主要用于新菌种的保藏、筛选研究。三角瓶的常用规格为100ml、250ml、500ml、1000ml等，较广泛地应用于培养基及培养条件，新工艺技术等的研究。7.3 实验室试验研究 7.3.1 实验室的生物反应器实验室中小规模的研究，常要用到各种型号的试管、培养皿、三角瓶等玻璃器皿。试管、

13、培养皿主要用于新菌种的保藏、筛选研究。三角瓶的常用规格为100ml、250ml、500ml、1000ml等，较广泛地应用于培养基及培养条件，新工艺技术等的研究。对于好氧型发酵过程的研究，主要借助的设备有气体自然交换的摇瓶发酵和强制通气的发酵罐发酵。 摇瓶试验是实验室研究的主要方式，是在一定大小体积的锥形烧瓶中装入一定量的培养基，经灭菌、接种、在摇瓶机上进行恒温振荡培养一定时间后，分析测定培养液中的参数变化和产物得率的试验。 试验中摇瓶的装载量一般为1020，如果太高会使发酵液溅到瓶口的棉塞，影响正常的通气及发酵。摇瓶试验的方法可用较少量的培养基，获得大量的数据，但因受到条件的限制，对菌体的生长

14、及发酵结果有一定的影响。 7.3.2 摇瓶试验瓶塞对氧传递的阻力摇瓶发酵对菌体生长的影响摇瓶内水分蒸发的影响与氧气接触的比表面积的影响 7.3.2.1 瓶塞对氧传递的阻力 为了保证瓶内的纯种培养，将瓶内发酵液与瓶外环境相隔绝，所以须配置适当的瓶塞。通常瓶塞的滤材有棉花、纱布、纤维纸、特殊的聚乙烯醇等。而一定厚度的过滤介质，可以杜绝外界空气中的杂菌或杂质进入瓶内，但同时增大了瓶外氧气的传递阻力。不同材质的瓶塞对氧的传递阻力是不同的，在某些情况下可能成为氧传递的限制性因素。因此，在实际工作中，在保证除去杂菌的前提下，尽量选用传递阻力小的瓶塞材质和合适的介质厚度。 7.3.2.2 摇瓶内水分蒸发的影

15、响摇瓶在振荡培养期间，由于发酵液中的水分经由瓶塞而蒸发，影响了发酵液的体积及各成分浓度，改变了发酵液与摇瓶总体积的比值，进而改变了氧的传递速率，而在发酵罐中发酵是不存在此问题的，所以水分的蒸发成为摇瓶试验中不可忽略的影响因素之一。 7.3.2.3 与氧气接触的比表面积的影响 为了保证瓶内的纯种培养，将瓶内发酵液与瓶外环境相隔绝，所以须配置适当的瓶塞。通常瓶塞的滤材有棉花、纱布、纤维纸、特殊的聚乙烯醇等。而一定厚度的过滤介质，可以杜绝外界空气中的杂菌或杂质进入瓶内，但同时增大了瓶外氧气的传递阻力。不同材质的瓶塞对氧的传递阻力是不同的，在某些情况下可能成为氧传递的限制性因素。因此，在实际工作中，在

16、保证除去杂菌的前提下，尽量选用传递阻力小的瓶塞材质和合适的介质厚度。 摇瓶发酵过程中氧气的提供，仅靠通过瓶塞过滤后的外界空气与发酵液液体表面接触而传递到液体内部。所以，氧的传递与发酵液的比表面积大小密切相关。 影响比表面积大小的因素主要有：(1)摇瓶机振荡的频率和振幅大小；(2)摇瓶内培养基体积与摇瓶总体积的比率，即装载量大小；(3)摇瓶的结构等方面 。 摇瓶机的振荡剧烈程度与氧的传递速率在一定程度上成正比，与培养基的装载量呈反比关系，装载量愈大，氧的传递速率就愈小，反之就大。 7.3.2.3 与氧气接触的比表面积的影响7.3.3.1 实验室研究内容 7.3.3 实验室研究和实验设计方法 微生

17、物发酵的实验室研究有以下内容： (1)选育优良菌株；(2)研究菌株的保藏条件及其稳定性；(3)研究菌株的性能；(4)研究菌株最优培养条件，即考查培养基最适组成、最佳的pH、温度、培养时间、通气程度等培养条件；(5)考察菌株实验室规模的培养技术。 7.3.3.2 实验室研究常用实验设计方法 试验中，常常需要考查多个因素、多个水平的影响。但按单个因素进行全面试验，如考察N个因素、R个水平，则需要进行NR个试验，需要消耗大量的人力物力和时间，因此，需要对因素进行合理的试验设计，通过尽量少的试验来获得尽量多的、可靠的试验信息。在数理统计中常采用统计学方法来进行最佳化条件的考察试验，目前在生物工程试验设

18、计中常采用的统计学方法有正交设计、均匀设计、响应面分析、遗传算法等。 正交设计 正交设计是研究多因素多水平试验常用的一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，正交试验设计是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。利用正交试验得出的结果比普通比较法所得结果对产量能提高1050%，有时甚至更高，目前正交试验在很多领域的研究中已经得到广泛应用。 均匀设计 均匀设计是基于试验点在整个试验范围内均匀散布，从均匀性角度出发的一种试验设计方法，是数论方法中的“伪蒙特卡罗方法”的一个应用，由我国方开泰和王元两位数学家于1978年创立。 它与正交设计法相比具有如下优点：试验次数少，每

19、个因素每个水平只做一次试验，试验次数与水平数相等，而正交设计的试验次数是水平数平方的整倍数；适当调整水平顺序，就可避免高(或低)档次水平相遇，以防试验出现意外现象；利用电子计算机处理试验数据，可迅速求得定量的回归方程式，便于分析各因素对试验结果的影响，定量地预测优化结果。 响应面分析法 响应面分析法，也称响应曲面法，可克服上述几种方法的不足。是一种将数学和统计学相结合的方法，综合了试验设计和数学建模，它将体系的响应(如发酵产量)作为一个或多个因素(如温度、基质浓度等)的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件。 响应面分析法的特点是试验设计合

20、理，可用最少的试验数和时间经济地对试验进行全面研究，科学地提出局部和整体的关系，对因子和试验结果(响应面)之间、因子之间的相互关系进行优化。 遗传算法 遗传算法是近年来发展起来的不同于传统算法的、概念全新的优算法，已被用于生物培养条件的优化设计。遗传算法是一类借鉴生物界的进化规律(适者生存，优胜劣汰遗传机制)演化而来的随机化搜索方法。 遗传算法主要特点是直接对结构对象进行操作，不存在求导和函数连续性的限定，具有内在的隐并行性和更好的全局寻优能力，采用概率化的寻优方法，能自动获取和指导优化的搜索空间，自适应地调整搜索方向，不需要确定的规则,是具有“生存检测”的迭代过程的搜索算法。 7.4.1 实

21、验室摇瓶与发酵罐培养的差异7.4 生物反应过程放大7.4.2 发酵罐规模改变的影响7.4.3 生物工艺过程放大的方法 生物反应过程工艺和设备改进的研究，首先在实验室中进行，然后再逐渐放大到较大的设备中进行。然而在实践中往往是从小罐中获得的规律和数据，常常不能在大罐中再现，这就涉及生物反应过程放大的问题，其本质是试验规模的变化引起差异。溶解氧的差异二氧化碳浓度的差异7.4.1 实验室摇瓶与发酵罐培养的差异菌丝受损的差异 7.4.1.1 溶解氧的差异 对于好氧发酵，溶解氧是重要的限制性基质之一，对微生物的生长、代谢具有重要的影响。通常在摇瓶及发酵罐中的氧的溶解速度大小是不同的，一般发酵罐因为是强制

22、通气带搅拌，培养液混合较均匀，其溶氧速率明显高于摇瓶，则使溶入培养液中溶氧浓度形成差异，这对发酵结果有较大的影响，特别是对溶氧要求高且敏感的菌株，在发酵罐中的生产能力与摇瓶相比提高很大。7.4.1.2 二氧化碳浓度的差异 发酵液中的CO2可来源于无菌空气和菌体代谢产生的废气。CO2在水中的溶解度随外界压力的增大而增加。发酵罐为了防止染菌，一般控制罐内压力略大于环境压力，处于正压状态，而摇瓶基本上是常压状态，所以罐中培养液的CO2浓度明显高于摇瓶。CO2对细胞呼吸和某些微生物代谢产物(如抗生素氨基酸)的生物合成有较大的影响。所以，在发酵罐及摇瓶中CO2浓度的不同，也会导致发酵结果的差异。 7.4

23、.1.3 菌丝受损的差异 摇瓶试验时，菌体只受到液体的冲击或与瓶壁摩擦的影响，机械损伤很小。而用发酵罐培养时，菌体特别是丝状菌，却受到搅拌叶的剪切力、冲击力等的影响，受到较大的损伤，其程度远远大于摇瓶发酵。 所以摇瓶及发酵罐，特别是带搅拌器的发酵罐，对菌体的损伤程度有较大差异，这也导致对菌体生长状况的影响不同。 种子质量的差异 培养基灭菌操作导致成分的差异 7.4.2 发酵罐规模改变的影响发酵罐结构参数不同带来的差异 7.4.2.1 种子质量的差异 发酵罐接种的种子量必须依据发酵罐体积、菌种生长速度快慢来确定种子的数量。发酵罐体积越大，需要的种子液体积越大，则需涉及种子扩大培养的级数和菌种繁殖

24、的代数就越多。菌种扩培的级数越多，则在每级扩培时培养环境的差异，将会增大种子质量的差异。菌体繁殖代数也会导致菌种质量的差异。 在菌体繁殖过程中出现菌体变异的几率越大，突变株的比例也就越大，使种子质量有差异，造成菌体生产性能不稳定，这就有可能引起发酵结果的差异。7.4.2.2 培养基灭菌操作导致成分的差异连续灭菌对培养基中营养成份的损坏程度较小，但只对较大体积的培养基才能适用，一般只适合规模生产。摇瓶和发酵罐试验的培养基均采用分批灭菌，其过程分为三个的阶段：预热期、维持期和冷却期。培养基体积越大，预热期和冷却期也越长，灭菌所消耗的时间也越长，对营养成分的损坏程度也越大。这样即使是采用相同配方的培养基，经灭菌后，对菌体发酵的影响也就不同，使发酵结果变化。 7.4.2.3 发酵罐结构参数不同带来的差异 发酵规模改变后，发酵