有机与生化课件

1、第十五章药物研究的生物化学基础第一节 生物药物制造的生物化学基础一、生物药物制备方法的特点1、目的物存在于组成非常复杂的生物材料中2、有些目的物在生物材料中含量极微，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率3、生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，所以分离过程注意保护有效物质的生物活性4、生物药物制造工艺几乎都在溶液中进行，各种理化因素和生物学因素对组分有综合性影响。5、为了保护目的物的活性和结构完整性，生物药物工艺多采用“逐级分离”的方法6、生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念完全不同生物药物分离制备方法的主要依据原理1、根据不同组分分配率的差别进行分离2、根据生物大分子的特性采用多种分离手段交

2、互进行。二、生物合成技术原理生物合成是利用生物细胞的代谢反应(更多的是利用微生物转化反应)来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。微生物转化反应是利用微生物的代谢才作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。生物合成技术的另一领域是半合成技术。 氨苄青霉素合成三、生物技术原理生物技术(botechnology)又称生物工程(bioengineering)，是利用生物有机体(动物、植物和微生物)或其组成部分(包括器官、组织、细胞或细胞器等)发展新产品或新工艺的一种技术体系。生物技术一般包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。三、生

3、物技术原理基因工程主要包括基因的分离、制备、体外剪切、重组、扩增、表达与产物的纯化等技术；细胞工程则包括一切生物类型的基本单位一细胞(有时也包括器官或组织)的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器(如线粒体、叶绿体等)的移植与改建等操作技术；酶工程是指酶的工业化生产及其固定化技术以及由酶制剂构成的生物反应器和生物传感器等新技术、新装置的研究应用；发酵工程也叫微生物工程，是在最适条件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品的一种生物工艺三、生物技术原理现代生物技术的核心内容主要包括重组DNA技术和单克隆抗体技术。生物工程药物是指运用重组DNA技术和单克隆抗体技术生产的多肽、

4、蛋白、激素和酶类药物以及疫苗、单抗和细胞生长因子类药物等重组DNA技术又称基因工程，其操作过程主要包括：目的基因的获取；基因载体的选择与构建；目的基因与载体的拼接；重组DNA导人受体细胞；筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞(转化子)；工程菌(或细胞)的大量培养与目的蛋白的生产。 图15-2 由染色体DNA和cDNA构建重组DNA生产目的蛋白示意图质粒载体A、基因DNA(从染色体DNA中分离)B、cDNA(从mRNA合成)编码目的蛋白的基因mRNA逆转录酶从mRNA合成cDNADNA聚合酶IdsDNA(双链DNA)目的基因DNA连接酶限制性内切酶转化进入宿主细胞筛选培养克隆将筛选的克隆发酵，生产

5、目的蛋白重组体质粒宿主DNA图15-2 A、染色体DNA、 B、cDNA构建重组DNA生产目的蛋白示意图（一）基因载体常用的基因载体(Vector)有质粒、噬菌体、M13噬菌体等。逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA是将外源基因导人动物细胞的载体。图15-3 pBR322质粒pBR322oriAmprTerrPst I 3609EcoR I 4361/0HindIII 29BamHI 375SalI 651AvaI 1425PvuII 2066（二）目的基因的来源1、 直接从染色体DNA分离。2、人工合成 3、从mRNA合成cDNA4、基因文库将生物体全部DNA提纯，用限制性内切酶随机切割成数以万

6、计的片段，所有片段均重组在同一类载体上，得到许多重组体，又全部转化人宿主菌中保存起来，这就是基因文库。用基因组(genome)的总DNA构建的为G文库用细胞全部mRNA经过反转录制备的cDNA后建库，则称为cDNA文库，（三）限制性内切酶的应用核酸限制性内切酶(restriction endonuclease)能特异识别核酸分子某些碱基序列并加以切开其切口类型有两种：一种为平端(blunt end)切口、另一种为粘端切口(sticky end)，即两链的切口错开24个核苷酸。表15-1 常用的限制性内切酶酶辨认的序列和切口说明Alu I四核苷酸，平端切口AGCTTCGABamH I 六核苷酸，

7、平端切口GGATCCCCTAGG Bgl I 六核苷酸，平端切口AGATCTTGTAGA 表15-1 常用的限制性内切酶酶辨认的序列和切口说明EcoR I 六核苷酸，平端切口GAATTCCTTAAG Hind III 六核苷酸，平端切口AAGCTTTTCGAA Sal I 六核苷酸，平端切口GTCGACCAGCTG Sma I 六核苷酸，平端切口CCCGGGGGGCCC （四）重组体的构建用同种限制性内切酶切割载体及目的基因后，无论产生的是平端切口或粘端切口，都可以用DNA连接酶把载体和目的基因连接起来，形成DNA重组体粘端连接方式：如用Hpa分别切割目的基因和质粒DNA，然后混合在一起，用连

8、接酶作共价连接形成DNA重组体，这种方法称为粘端连接方式。还有“尾接法”连接方式。在载体和目的基因上找不到共同的酶切位点时，可先把它们各自的粘端切口用单链核酸酶切平、在末端核苷酸转移酶作用下，催化脱氧单核苷酸加于DNA的3末端，使形成粘端结构。如一股DNA加上polyC，另一股DNA的3曰末端加polyC，因C-C互补配对，两种DNA经连接酶处理，也可以形成共价结构的重组体。图15-4 粘端连接方式CCGGGGCCGGCCCCGGCGGCGGCC哺乳动物DNA片断限制性内切酶HpaIICCGGGGCCCGGCGGCC限制性内切酶HpaII+混合，退火DNA连接酶CCGGGGCCCCGGGGCC

9、细菌质粒与哺乳动物DNA片段共同构成的重组质粒（五）重组体的转化转化(transformation) ：重组体如系大肠杆菌质粒，可在0-4用CaCl2处理大肠杆菌，以增大其细胞膜的通透性，再将CaCl2处理过的受体细菌与重组质粒温育，使质粒透人菌体，将重组DNA导人宿主细胞以改变其某些特性，此过程称为转化作用转导(transduction):重组体如系噬菌体DNA，可进行体外包装，将其包人入噬菌体的头部外壳蛋白，并使其含有尾部蛋白，成为有侵染力的噬菌体，以导人宿主细胞。亦可用CaCl2处理宿主细胞，将重组DNA直接引入细胞，以供体DNA通过噬菌体导人细胞引起的转化作用称为转导(transduc

10、ion)。 （六）重组体的筛选与鉴定在重组体导人宿主细胞后，经初步扩增后还应加以筛选，以获得含目的基因的工程菌(或细胞)，并鉴定之。1、根据重组体的表型进行筛选2、限制酶切图谱分析鉴定3利用核酸杂交技术进行鉴定 DNA重组技术的主要应用运用DNA重组技术大量生产基因工程药物；定向改造生物的基因结构，构建高产菌株，用于改造传统制药工业；用于基础研究，如用于基因结构与基因组功能的调节研究，通过扩增目的基因、制造基因探针，用于分子杂交操作。细胞工程细胞工程技术系运用细胞学和遗传学的方法按照人们的预先设计，有计划地改造细胞的遗传基础，以期获得人类所需要的具有某些特性和功能的新细胞。根据所要改造的遗传物

11、质的结构层次一般可分为基因工程、染色体工程、染色体组工程、细胞质工程及细胞融合(体细胞杂交)等。主要工作内容有细胞培养、细胞融合，细胞拼合，染色体导人和基因转移等。基因的直接移植与转基因动物基因在细胞内的转移一般采用体外培养细胞显微注射技术用显微吸管吸取基因或带基因的质粒，在显微镜下借助特殊的注射装置，把目的基因注入受体细胞核内，通常是将目的基因注入早期胚胎内或受精卵的膜内，如把人或哺乳动物的某种基因导人到哺乳动物的受精卵里，若导人基因与受精卵里的染色体整合在一起，细胞分裂时，染色体倍增，基因也随之倍增，每个细胞里都带有导人的基因，而且能稳定地遗传到下一代。这样一种新的个体，称为转基因动物。

12、单克隆抗体(monoclonal antibody)由一个杂交瘤细胞及其后代产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。杂交瘤细胞是将骨髓瘤细胞与受免脾淋巴细胞融合而获得的。杂交瘤细胞继承了两个亲本细胞的遗传特性，既能分泌抗体又能快速无限地生长繁殖。图15-5 杂交瘤细胞与单克隆抗体制造示意图培养骨髓瘤细胞抗原注入小鼠体内收集骨髓瘤细胞用PEG促使细胞融合得到杂交瘤细胞分离受免疫脾淋巴细胞在HLT培养基中培养克隆杂交瘤细胞筛选产生专一性抗体的杂交瘤细胞扩大组织培养生成腹水瘤单抗产品分离纯化分离纯化第二节 药物质量控制的生物化学基础一、药物质量控制的常用生化分析法（一）免疫法1、免疫扩散法2、免疫电

13、泳法3、放射免疫测定法4、酶联免疫测定法（二）电泳分析法电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其所带电荷相反的电极方向移动。常用的介质电泳有纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳。毛细管电泳的分离机制是根据被分析物质在单位电场中的泳动速率不同而将物质分开。（三）酶法分析酶法分析的原理是借助酶促反应(包括单酶或多酶偶联反应)对酶或酶所作用的底物或参与酶促反应的辅酶、激动剂和抑制剂等进行定性、定量分析。1、终止反应法2、连续测定法3、循环放大分析法表15-2 酶法分析的特点二、生物药物质量控制的生化分析法（一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法1、蛋白质药物的纯度分析2、多肽与蛋白质分子量的测定凝胶层析法SDS3、蛋白质的定量测定物理性质：紫外分光光度法，折射率法，比浊法化学性质：凯氏定氮法，双缩脲比色法，Folin酚法，BCA法染色性质：考马斯亮兰G-250