第八章基因重组和杂交育种ppt课件

1、第三节 基因重组和杂交育种凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一同，经过遗传分子间的重新组合，构成新遗传型个体的方式，称为基因重组gene recombination或遗传重组genetic recombination，简称重组。重 组杂交（hybridization）遗传物质分子水平上的杂交 细胞水平 细胞程度的杂交包含分子程度上的重组。 基因重组是杂交育种的实际根底。在方向性还是自觉性方面，比诱变育种前进了一大步。且可消除某一菌株在经过长期诱变处置后所出现的产量上升缓慢的景象，因此，它是一种重要的育种手段。 一、原核生物的基因重组原核生物的基因重组方式很多，机制较原始。特点： 片段性，仅

2、一小段DNA序列参与重组； 单向性，即从供体菌向受体菌或从供体基因组向受体基因组作一方向转移； 转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。受体菌recipient cell，receptor直接吸收供体菌donor cell的DNA片段而获得后者部分遗传性状的景象，称为转化或转化作用。经过转化方式而构成的杂种后代，称转化子transformant。一转化transformation 1. 定义自然遗传转化natural genetic transformation人工转化artificial transformation原核生物Streptococcus pneumoniae肺炎链球菌、Hae

3、mophilus嗜血杆菌属、Bacillus芽孢杆菌属、Neisseria奈瑟氏球菌属、Rhizobium根瘤菌属、Staphylococcus葡萄球菌属、Pseudomonas假单胞菌属、Xanthomonas黄单胞菌属等。2. 转化微生物的种类真核微生物Saccharomy cescerevisiae酿酒酵母、Neu-rosporacrassa粗糙脉孢菌、Aspergillusniger黑曲霉等。3. 感受态competence感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理形状。研讨发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。 感受态细胞competent cell具有摄取外源

4、DNA才干的细胞。自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌本身的基因控制；人工感受态那么是经过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的才干，或人为地将DNA导入细胞内。该过程与细菌本身的遗传控制无关！感受态受遗传控制，但也存在个体差别。感受态出现的时间不同；感受态细胞所占比例和维持时间不同；外界环境因子如腺苷酸cAMP及Ca2等对感受态也有重要影响。调理感受态的一类特异蛋白称感受态因子。膜相关DNA结合蛋白membrane-associated DNA binding protein细胞壁自溶素autolysin几个核酸酶4. 转化因子transforming principle 转化因子

5、的本质是离体的DNA片段。普通只需15kb左右。在不同的微生物中，转化因子的方式不同。良好的转化因子有dsDNA最宜于细胞外表结合、ssDNA和质粒DNA，通常不能与核染色体组发生重组。转化的频率通常为0.11.0，最高为20。能发生转化的最低DNA浓度极低，为化学方法无法测出的1105mgmL即11011gmL 。5. 转化过程1自然遗传转化简称自然转化 1928年，Griffith发现肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae的转化景象，转化过程研讨得较深化的就是这种G细菌。目前知有二十多个种的细菌具有自然转化的才干进展自然转化，需求二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞

6、外源游离DNA分子枯草芽孢杆菌的自然转化过程革兰氏阳性菌的转化模型strR，存在抗链霉素的基因标志strS，有链霉素敏感型基因标志自然转化过程的特点：a对核酸酶敏感；c转化能否胜利及转化效率的高低主要取决于转化DNA供体菌和受体菌之间的亲源关系；d通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；b不需求活的DNA给体细胞；提高质粒的自然转化效率的二种方法：1使质粒构成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；2在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌重组获救。2人工转化用CaCl2处置细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的根底

7、上开展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和根底技术。不是由细菌本身的基因所控制；用多种不同的技术处置受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态。质粒的转化效率高；指用提纯的病毒核酸DNA或RNA去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的景象。6. 转染transfection噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒如今把DNA转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体DNA以转化的而非感染途径进入细胞并表达后产生完好的病毒颗粒。特点：转染转化把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞 以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞 二转导trans

8、duction经过缺陷噬菌体defective phage的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，经过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的景象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，就称转导子transductant。由噬菌体介导的细菌细胞间进展遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA经过病毒载体的感染转移到另一个细胞中 能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导流产普遍转导完全普遍转导1.普遍转导generalized transduction 经过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段DNA进展“误包，而将

9、其遗传性状传送给受体菌的景象，称为普遍转导。普通用温暖噬菌体作为普遍转导的媒介。1完全普遍转导 简称普遍转导或完全转导complete transduction。经转导嗜菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内进展交换、整合和复制，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作普遍转导子，这种景象就称普遍转导。Salmonella typhimurium鼠伤寒沙门氏菌的野生菌株Salmonella typhimurium鼠伤寒沙门氏菌的营养缺陷型突变株P22嗜菌体供体菌受体菌转导模型供体菌受体菌转导媒介嗜菌体误包转导颗粒普遍转导子双交换同源配对10-610-8S.typhimuri

10、um的P22噬菌体、E.coli的P1噬菌体、Bacillus subtilis的PBS1和SP10等噬菌体都能进展完全普遍转导。供体菌转导媒介嗜菌体受体菌2流产普遍转导 简称流产转导abortive transduction。经转导嗜菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内既不进展交换、整合和复制，也不迅速消逝，而仅进展转录、转译和性状表达，这种景象就称流产转导。受体菌外源DNA细胞分裂外源基因经转录、转译而构成的少量酶获得外源DNA获得少量酶不断稀释特点：在选择培育基平板上构成微小菌落DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，构成微小

11、菌落。普遍性转导的三种后果：进入受体的外源DNA经过与细胞染色体的重组交换而构成稳定的转导子。流产转导abortive transduction转导DNA不能进展重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培育基平板上构成微小菌落外源DNA被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，构成微小菌落。2.局限转导specialized transduction， restricted transduction 指经过部分缺陷的温暖噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，构成转导子的景象。 最初于19

12、54年在E. coliK12中发现。特点： 只局限于传送供体菌核染色体上的个别特定基因，普通为噬菌体整合位点两侧的基因； 该特定基来由部分缺陷的温暖噬菌体携带； 缺陷噬菌体的构成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率10-5“误切不正常切离，abnormal excesion或由于双重溶源菌的裂解而构成； 局限转导噬菌体的产生要经过UV等要素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。局限转导低频转导高频转导根据转导子出现频率的高低分类温暖噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺

13、陷的温暖噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中缺陷噬菌体在宿主细胞内可以象正常的DNA分子一样进展复制、包装，提供所需求的裂解功能，构成转导颗粒。但没有正常噬菌体的溶源性和增殖才干，感染受体细胞后，经过DNA整合进宿主染色体而构成稳定的转导子。E. coli的嗜菌体和80嗜菌体具有局限转导的才干。3.溶源转变lysogenic conversion 正常的温暖噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主核基因组上，而使宿主获得了除免异性外的新遗传性状的景象，称溶源转变。一个与转导类似又不同的景象溶源转变与转导的不同？a这是一种不携带任何外源基因的正常时菌体；b是嗜菌体的基因

14、内而不是供体菌的基因提供了宿主的信性状；c新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组构成的稳定转导子；d获得的性状可随嗜菌体的消逝而同时消逝；三接合conjugation，mating 供体菌“雄性经过性菌毛与受体菌“雌性直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传送给后者，使后者获得假设干新遗传性状的景象，称为接合。经过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是接合子conjugant。1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验经过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间

15、发生了遗传交换和重组所致！大肠杆菌的接合机制接协作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛sex pili及控制接合过程进展的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性菌株F+，其细胞外表有性菌毛不含F因子的细胞：“雌性菌株F-，细胞外表没有性菌毛F因子为附加体质粒可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入整合到染色体上F因子的四种细胞方式aF-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以经过接协作用接纳F因子而变成雄性菌株F+；bF+菌株， F因子独立存在，细胞外表有性菌毛。cHfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞外表有性菌毛。dF菌株，Hfr菌株内的F因

16、子因不正常切割而脱离染色体时， 构成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。 细胞外表同样有性菌毛。四原生质体交融protoplast fusion经过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进展交融，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为原生质体交融。由此法获得的重组子，成为交融子fusant。选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标志的细胞作为亲本脱壁酶细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处置，真菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶等离心聚集在高渗溶液中稀释参与促交融剂或电脉冲各种选择性培育基原生质体交融的主要步骤是：原生质体交融的重组频率已大于10-1而诱变育种普通仅为10

17、-6；同种的不同菌株间或种间进展交融，属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的交融，以期到达消费性状更为优良的新物种。二、真核微生物的基因重组有性杂交准性杂交原生质体交融遗传转化一有性杂交sexual hybridization杂交是在细胞程度上发生的一种遗传重组方式。有性杂交，普通指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进展的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。二准性杂交parasexual hybridization准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种两性生殖方式，这是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生交融，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。 准性生殖过程：1菌丝结合anastomosis 2构成异核体heterocary