8第八章原位杂交组织化学ppt课件

1、第八章 原位杂交组织化学原位杂交组织化学ISHH原理：用标志的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。特点：杂交在载玻片上的细胞进展。分类：根据所用探针和靶核苷酸不同- DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交、 RNA-RNA杂交根据探针标志物能否直接被检测 直接法、间接法一 原位杂交的由来与开展一核酸分子杂交技术按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种液相杂交：参与反响的两条核酸链都游离在溶液中。 液相分子杂交技术包括： 吸附杂交 发光液相杂交 液相夹心杂交 复性速率液相分子杂交固相杂交： 是将参与反响的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼

2、龙膜、乳胶颗粒和微孔板等，另一条参与反响的核酸链游离在溶液中。固相杂交技术包括： 菌落原位杂交 斑点杂交法 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 组织原位杂交二原位杂交技术的开展在近20年飞跃开展的突出特点： 由分子遗传学研讨提供的探针大量添加； 探针消费的可靠性和速率大大开展了； 非放射性标志物的开展使原位杂交技术成为实验室的常规技术和临床日常运用的诊断技术。 新的非放射性标志技术正在继续不断涌现。二 原位杂交组织化学根本技术原位杂交的根本方法和运用原那么： 杂交前预备，包括固定、取材、玻片和组织的处置，如何加强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； 杂交； 杂交后处置； 显示vi

3、sualization： 放射性自显影显色、非放射性标志显色一原位杂交的根本要求1 固定2 玻片和组织切片的处置3 杂交4 杂交后处置5 显示6 对照实验和ISHH结果的判别 1 固定 固定剂的运用和选择原那么： 坚持细胞构造； 最大限制地坚持细胞内DNA或RNA程度； 使探针易于进入细胞或组织。 DNA：比较稳定，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不非常重要。RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解减少到最低限制，固定剂的种类、浓度和固定的时间非常重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。固定剂：多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouins固定剂、 Carnoys液 优缺陷： 沉

4、淀性固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouins液、 Carnoys液 能添加核酸探针的穿透性，但不能最大限制地保管RNA， 且对组织构造有损伤。 戊二醛：能较好地保管RNA和组织形状构造，但由于和蛋白质 产生广泛的交叉衔接，从而影响了核酸探针的穿透性。 多聚甲醛：仍被公以为ISHH较为理想的固定剂。 多聚甲醛mRNA的定位 将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中12h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱过夜，次日切片或保管在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气枯燥后保管在-70。如冰箱温度恒定，在-70可保管数月

5、之久不会影响杂交结果。病理学活检取材 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。石蜡包埋切片 由于与蛋白质交叉衔接的添加，影响核酸探针的穿透，因此杂交信号常低于冰冻切片，同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。冷冻切片 运用多聚甲醛蒸汽固定枯燥后的冷冻切片也可获得称心效果。2 玻片和组织切片的处置 1玻片的处置 热肥皂刷洗 自来水清洗 清洁液中浸泡24h 清水洗净 烘干 95%酒精中浸泡24h 蒸馏水冲洗 烘干 烘箱温度150过夜以去除RNA酶 盖玻片硅化处置 锡箔纸包裹无尘存放2加强组织的通透性和核酸探针的穿透性 根据运用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核

6、酸探针长度而定。 常用方法： 稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100、酒精或某些消化酶等。 优点: 经过去蛋白作用加强组织通透性和探针的穿透性,提高杂交信号. 缺陷: 减低RNA的保管,影响组织构造形状.因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。3减低背景染色 预杂交Prehybridization: 是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可到达封锁非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。杂交后洗涤: 采用低浓度的RNA酶溶液20g/ml洗涤一次，去除残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。4防止RNA酶的污染 在

7、整个杂交前处置过程都需戴消毒手套。 一切实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤消除RNA酶,亦可用消毒锅。 要破坏RNA酶，最低温度必需在150左右。 消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标志和防止取出 时空气污染。 杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处置。3 杂交Hybridisation杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。 是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。 杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。 加盖片的目的 防止孵育过程中的高温50左右导致杂交液的蒸发; 硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑,无气泡,不会影响组织切片与杂交液的接触; 盖玻片

8、本身分量能与杂交液吸附到达覆盖和防蒸发的作用。杂交留意环节 1探针的浓度 原那么:探针浓度必需给予该实验最大的信/噪比值。最正确原那么应是运用最低探针浓度以到达与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。杂交液的量要适当:以1020l/每张切片为宜。杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动零落,过量的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。 2探针的长度 最正确长度应在50100个碱基之间。 探针短- 易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 500个碱基的探针- 杂交时间约需20h左右。 200500个碱基的探针- 可运用. 超越500个碱基的探针- 在杂交前最好用碱或水解酶进 行水解，使其变成

9、短的片段， 到达实验所需求的碱基数。 3杂交的温度和时间 杂交温度： DNA或RNA需加热或变性、解链后才干进展杂交。原位杂交中，DNA、RNA探针需求的Tm分别是90、95，这种高温对保管组织形状完好和坚持组织切片粘附在载玻片上是不能够的。因此，在杂交液中参与盐和甲酰胺，减低Tm。根据探针的种类不同，温度略有差别。 杂交时间： 16-20h或孵育过夜甲酰胺：在杂交液中占50%左右；调理杂交反响温度，利于坚持组织形状构造；防止低温时非同源性片段结合；但具有破坏氢键的不稳定作用。硫酸葡聚糖：在核酸杂交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水协作用，因此能大大添加杂交液

10、的粘稠度；促进杂交率，特别是对双链核酸探针。甲酰胺和硫酸葡聚糖： 4杂交严厉度Hybridization stringency 杂交严厉度：表示经过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。 错配对杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，经过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的构成，提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反响亦然。低严厉度：杂交及冲洗条件在Tm3540之间，高盐或低甲酰胺浓度。大约有70%90%的同源性核苷酸序列被结合，可导致非特异性杂交信号的产生。 中严厉度：Tm 20-30的范围。高严厉度：为 Tm10-15，低盐和高甲

11、酰胺浓度。只需具有高同源性的核苷酸序列才干构成稳定的结合。4 杂交后处置包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。目的：经过杂交后的洗涤将组织切片中非碱基配对除去，有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。洗涤的条件：如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标志的种类不同而略有差别，普通遵照的共同原那么是盐溶液浓度由高到低，而温度那么由低到高。本卷须知： 漂洗过程中切勿使切片枯燥。枯燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而加强了背景染色。 放射性标志探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法测背景染色作为改善漂洗程序的指针。5 显示 Visualization 又称检测系

12、统 Detection system根据核酸探针标志物的种类分别进展放射自显影或利用酶检测系统进展不同显色处置。放射自显影： 图象分析仪检测银粒的数量和分布的差别。 非放射性核酸探针杂交的细胞或组织： 酶检测系统显色 显微分光光度计或图像分析仪检测。6 对照实验和ISHH结果的判别 Northern 和 Southern印迹杂交法。 可用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质或多肽水平和转录程度在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应mRNA共存于同一细胞中。 预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技术证明丧失的是DNA或RNA。事先与特异性的cRNA或cDNA进展杂交。再进展I

13、SHH，其结果应为阴性。由于同一RNA探针和组织内 mRNA序列顺序是一样的，运用其进展ISHH，结果应为阴性。 检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标志探针的情况下进展。 多要素都将影响ISHH的实验结果。二核酸探针1 核酸探针的种类2 探针的标志与运用 1 核酸探针的种类 1按标志方式分类 直接法和间接法： 直接标志探针 运用藕联异硫氰酸荧光素FITC或罗丹明Rhodamine等荧光物质的dNTP或NTP直接标志探针，杂交洗涤后即可在显微镜下检测。 间接标志探针 采用生物素或地高辛等半抗原分子作为分子标志探针，杂交洗涤后分别用抗生物素抗体和抗地高辛抗体作为配体进展检测，配体上分别连有不

14、同的荧光物质，在荧光显微镜下察看分析。两种方法的比较：1直接标志的DNA探针杂交后经过简单洗涤就可显示杂交信号，简一方便，而间接标志的探针杂交后需经过繁琐的检测步骤；2间接标志的探针可进展多步骤信号放大，但其受配基亲和力的影响。而直接标志的信号放大普通遭到限制，目前多用Dupon公司的TSA系统进展直接标志信号的放大。3对于多色FISH，往往选择直接标志法标志探针。 2按核酸性质分类 DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针3按染色体上位置分类： 反复序列探针 涂染探针 基因探针及其它2 探针的标志与运用 切口平移法Nick translation随机引物法 (Random Prim

15、er)末端标志法PCR标志法体外转录标志法不同模板需不同标志方法 生物素标志cRNA探针在原位杂交组织化学中的运用1 光敏生物素标志cRNA探针的运用2 酶促生物素标志cRNA探针的运用1 光敏生物素标志cRNA探针的运用 光敏生物素标志核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照1020min，生物素就结合在DNA或RNA分子上，属于化学修饰法，此方法简单；本钱低；适用于大量制备50ug。光敏生物素试剂种类： 光生物素乙酸盐 补骨脂素生物素。 生物素-聚乙二醇-当归素BPA：在长波UV下它可与DNA碱基共价键结合。BPA反响物与DNA结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反响，这个特异性可使BPA

16、只标志粗制细胞裂解物中的核酸，而不标志蛋白、多糖和其他细胞大分子。光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序如下： 石蜡切片脱蜡入水后，PBS洗；冰冻切片直接入PBS洗。 0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。 0.4%Trixtion X-100 PBS洗15min。 1ug/ml蛋白酶K，37保温30min。 4%多聚甲醛PBS固定。 0.1mol/L PBS洗23min。 0.25%乙酸酐10min。 2SSC洗10min。 取10ul含相应探针的杂交液滴于标本上，假设是cDNA探针，那么用前将探针于95水浴中保温10min，马上冰浴冷却，然后再用。10 盖上硅化盖玻片或蜡膜，43湿盒保温12

17、16h。11 4SSC洗脱盖片，并在同一液中，37漂洗10-30min。12 2SSC含20ug/mlRNaesA，适于RNA探针37洗30min。13 1SSC，0.1SSC，37各漂洗10-30min。14 0.05mol/L PBS洗45min。15 3%BSA0.4%Triton X-100 PBS配37保温30min。16 碱性磷酸酶室温13h。17 0.05mol/L PBS洗45min。18 缓冲液洗25min。19 缓冲液洗25min。20 NBT/BCIP液显色，室温，暗处3h。21 20mmol/L EDTA，pH8.0终止显色。22 甘油明胶直接封片。2 酶促生物素标志c

18、RNA探针的运用原理：酶促生物素标志探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸掺入到探针DNA 中，制成标志探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，本钱高。反响步骤如下： 用PBS冲洗黏附有切片的载玻片。 将载玻片浸入0.3%H2O2，以封锁内源性过氧化物酶。 PBS洗23min，参与抗生物素血清和正常山羊血清，室温1h或4过夜。 PBS洗23min。 加生物素化室温30min孵育。 PBS洗23min。 运用ABC复合物与等量的1%牛血洁白蛋白-PBS液混合，室 温孵育1h。 PBS洗23min。 DAB溶液孵育3-15min。 水洗，复染，脱水，透明和以甘油/P

19、BS或DPX封固。地高辛标志cRNA探针的运用地高辛标志cRNA探针的运用原理： 地高辛Dig为类固醇半抗原，仅存在于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物无交叉反响，地高辛标志于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷dUTP上构成Dig-11-dUTP。经过随即引物或缺口平移法，将Dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标志的核酸探针。 将这种标志的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的抗地高辛抗体结合物作为酶标或荧光标志，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以到达检测目的。 常用的免疫酶学检测方法： Dig-HRP检测系统：

20、 以DAB/H2O2为底物，结果为棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。 Dig-AKP检测系统： 以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。 AKP灵敏度和分辨率较HRP高，但HRP的优点为廉价、稳定。地高辛标志的核酸探针较稳定，-20储存可达2年，随时可以取用，但在现实运用中，人们仍采用新颖的地高辛标志3-6个月以内的核酸探针。为节省核酸探针的用量，凡运用过的含有探针的杂交液也可反复多次运用。地高辛标志探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保管。与生物素标志探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。 由于地高辛标志cRNA探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的运用，我们在根本方法中较详细的表达其操作过程 。地高辛探针的运用 根本操作步骤： 1组织处置 冷冻切片：切片贴在预先清洁、高温处置并涂以粘附剂的载玻片上，先在37预枯燥4h，然后置于37烤箱中过夜。经过上述处置的切片在-20可保管周，在-70可保管数月之久，也有报告可保