PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

1、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析【实验目的】学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；掌握群体遗传学基因频率与基因型频率的计算方法。【实验原理】凝胶电泳是分离、鉴定、纯化及制备DNA片段最常用的方法，可分为两类， 一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于l kb和大于l kb以上DNA；另一类是聚丙烯酰 胺凝胶电泳，适用于小于lkb的DNA。琼脂糖凝胶电泳是一种简便易行的分离、 纯化和鉴定DNA片段的方法。分为水平板和垂直板两种，一般采用水平电泳。琼脂糖凝胶在DNA分子泳动时兼有“分子筛”和“电荷”的双重作用。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于琼脂糖凝胶具有网络结构，因此电泳时

2、，带电颗粒的分离速度不仅取决 于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。由于实验中相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样 的速度向正极移动。相对分子质量小者泳动快，大的泳动慢。漠化乙锭是分子生物学实验中常用的DNA荧光染料，含有一个可以嵌入 DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异 性。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被吸收的能量在可见光谱红橙区的 590nm处重新发射出来。漠化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料 高出20-30倍。所以当凝胶中含有游离的漠化乙锭（0.5g/mL）时，可以检测到少至10ng的

3、DNA条带TBE （成分：Tris，EDTA，硼酸，蒸馏水）的作用：稳定体系酸碱度（正负极氧化还原反应，使正极变酸、负极变碱性）使溶液具有导电性，以利于DNA分子的迁移其中的EDTA螯合镁离子，防止电泳时激活DNA酶引物二聚体：引物二聚体是引物的3端间相互错配扩增形成的。引物二 聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代 表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。优化PCR的实验条件（包 括提高退火温度，降低引物浓度等）可大大降低二聚体的浓度。11. Loading Buffer指示剂漠酚蓝，可以显示电泳的进程；甘油成分增加样品密度，是样品密度大于电泳缓冲液

4、，防止样品飘出点样孔。【实验过程及注意事项】（实验所用试剂及其作用）实验准备器材 离心机、离心管、记号笔、移液器、移液器吸头、琼脂糖凝胶电泳系统、 紫外透射箱等。试剂 0.5XTBE、上样缓冲液（loading buffer）、琼脂糖、漠化乙锭、DNAmarker 等。材料PCR扩增产物。制备琼脂糖凝胶：用1%TBE150ml缓冲液（1XTBE）溶解2.25g琼脂糖，放入三角瓶中，微波炉 加热煮沸（注意摇动时避免产生气泡），待琼脂糖完全溶解后，冷却至60C （不 烫手），加10ulEB，混匀、倒胶。制板：将胶倒入制胶板内，室温下充分凝固（约2h），竖直拔下梳子。将凝胶放入电泳槽内，加入缓冲液，

5、没过胶面12mm。点样：（上样时要轻、稳、准、快）注意：1%TBE缓冲液没过胶面广2mm，用移液器小心加入10ul PCR产物，留出 5ul Marker 的位置。电泳：接通电源，注意电极方向，电泳约25分钟。观察：取下琼脂糖凝胶，放置在紫外投射箱中观察。分析。汪意事项电泳通常选择直流电源，电压在1-2V/cm,在25C左右的室温中进行。温度过高会加速DNA分子扩散，使条带变宽、模糊。注意每个上样孔的载样量，太少会使条带不明显；太多则会造成条带拖尾。EB可以嵌入碱基分子中，导致错配。许多人认为漠化乙锭是强诱变剂，具有高 致癌性。不可以直接接触。拔梳子时候要垂直拔出。【实验结果与讨论】（上传琼脂

6、糖凝胶电泳结果图片，是否得到电泳条带，并说 明原因）本人得到了电泳条带，本班电泳条带比例为II型13人，ID型11人，DD型9人。本班内：I 的基因频率为（13*2+11） /66=0.56;D的基因频率为0.44部分人没有得到条带，可能是以下原因：1上样液发生扩散飘移，而扩增浓度达不到，电泳结果不明显。DNA提取量太少，眼科剪未剪碎棉签头部，导致棉签头部过大，离心后吸取 DNA提取液（上清液），造成了 DNA提取液量比较少；也有可能是棉签刮擦力度不够，导致未得到电泳条带琼脂糖凝胶电泳结果图【思考题】某研究小组调查了某地区1000名无关个体ACE基因I/D的多态性分 布，其中608名为II基因型，ID基因型个体的基因型频率为0.32, DD基因型个 体38人，50人未检出，计算等位基因I与D的基因频率。50人未检出，即实际检出950人故：ID基因型人数：0.32*950=304人基因频率：群体中等位基因D的频率：p= (38x2+304) /1900=0.20群体中等位基因I的频率：q= (608x2+304) /1900=0.80答：I基因频