浅谈木犀草素对对乙酰氨基酚诱导的L02肝细胞损伤的保护作用9200字

1、浅谈木犀草素对对乙酰氨基酚诱导的L02肝细胞损伤的保护作用9200字 木犀草素，多以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高。具有镇咳和祛痰作用。据最新研究，呼吸道病症咳嗽、咳痰、喘息，均与气道慢性炎症有关。如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、变应性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被认为与部分的炎症浸润有关，炎症的存在，使得气道的免疫应答混乱，患者常出现气道反响性增高。摘要 讨论木犀草素(luteolin，Lut)对对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)诱导的L02肝细胞损伤的保护作用。CCK8法检测Lut对L02细胞活性的影响;挑选

2、APAP诱导L02细胞损伤的浓度及作用时间;细胞形态学、CCK8实验和流式细胞术检测分析Lut对APAP诱导的L02细胞凋亡的影响;比色法检测细胞上清液中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)活性;RTPCR检测凋亡相关基因Bax，Bcl2，caspase3的表达。结果显示Lut在2.540 mu;mol#12539;L-1不影响L02细胞活性;12 mmol#12539;L-1 APAP作用于L02细胞12 h可用于建立肝细胞损伤模型。与模型组相比，Lut组细胞状态明显改善，胞体增大，贴壁才能恢复明显;细胞凋亡率明显下降;MDA含量显著下降(P关键词 木犀草素;

3、L02细胞; 氧化应激; 细胞凋亡; 对乙酰氨基酚对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一种常见的解热镇痛药，APAP在治疗剂量下平安，但过量使用会造成急性肝损伤1。APAP过量服用在许多国家已成为成心或意外死亡的原因之一23。目前，有证据证实细胞内氧化应激是APAP引起急性肝损伤的重要生物学机制之一47，因此，讨论可以有效预防或缓解APAP引起的急性肝损伤途径具有积极的临床意义。木犀草素(luteolin，Lut)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、金银花、紫苏叶等植物中，近年研究说明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用811。本文通过预防性给药，研究给

4、药后氧化应激损伤相关生理指标变化，讨论Lut的细胞保护和抗凋亡作用，为对乙酰氨基酚肝损伤的防治提供进一步的实验根据。一、材料1.1 细胞 正常人肝细胞株(L02)为本实验室保存。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基在37 ，5% CO2且饱和湿度条件下进展常规培养。1.2 药品与试剂 DMEM(高糖)培养基购自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素均购自GIBCO公司;Cell Counting Kit8 (CCK8)购自东仁化学科技(上海);木犀草素(luteolin，Lut)、五味子乙素(schizandrin B，Sch B)均购自成都普菲德生物技术;APAP购自中国食

5、品药品检定研究院;AnnexinVFITC/PI试剂盒购自Sigma公司;谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;逆转录和PCR反响试剂盒购自Thermo Fisher Scienfitic公司;Bax，Bcl2，caspase3引物均购自Invitrogen公司。1.3 仪器 酶标仪( BioTek Synergy H1 H1MFD，美国);DMIL HC型倒置相差显微镜(Leica，德国);流式细胞仪(BD FACS Canto )。二、方法2.1 细胞培养 L02细胞培养按照常规培养的方法，含10%胎牛血清、100 kU#12

6、539;L-1青霉素和100 g#12539;L-1链霉素的DMEM(高糖)培养基，37 ，5% CO2培养箱培养。2.2 CCK8检测Lut对L02细胞活性的影响 将L02细胞以7x104个/mL接种于96孔板，每孔100 mu;L，接种12 h细胞全部贴壁后，分别给予0，2.5，5，10，20，40，80，160 mu;mol#12539;L-1的Lut，实验设阴性对照孔和空白对照孔，每个浓度设3个复孔。在37 ，5% CO2的培养箱中培养8 h后CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。细胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)x100%，式中Ac为对照孔吸光度，As为实验孔吸光度，

7、Ab为空白孔吸光度。2.3 APAP诱导L02细胞肝损伤模型的建立 将浓度为7x104个/mL的L02细胞接种到96孔板，每孔100 mu;L，接种12 h细胞全部贴壁后，设0，6，12，18，24，30 mmol#12539;L-1浓度梯度的APAP进展造模，实验设阴性对照孔和空白对照孔，每个浓度设3个复孔，分别在造模3，6，12，24，48 h后弃上清液，用CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。2.4 Lut对APAP诱导L02细胞损伤的影响 实验分6组，分别是对照组、模型组(APAP，12 mmol#12539;L-1)、3个实验组(Lut，浓度分别为2.5，5，10 mu;mo

8、l#12539;L-1)和阳性对照组(五味子乙素12，Sch B，5 mu;mol#12539;L-1)。取对数生长期L02细胞，调整细胞数为7x104个/mL，接种于96孔板中，37 ，5% CO2培养箱中培养12 h，实验组和阳性对照组更换为相应的含药培养液，对照组和模型组更换新的完全培养液，继续培养8 h后，除对照组外，其余各组参加APAP 12 mmol#12539;L-1造模，造模12 h，于倒置显微镜下观察细胞形态后弃上清液，用CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。2.5 AnnexinV FITC/PI双标记法检测细胞凋亡 将L02细胞按照1x105个/mL 接种到6孔板

9、中，每孔2 mL，分组、给药及造模同2.4项，造模12 h后，将L02细胞消化下来，按照Annexin VFITC/PI说明书方法对细胞进展染色，利用流式细胞仪检测L02细胞凋亡情况。2.6 培养液MDA，GSH及SOD程度的检测 将L02细胞按照1x105个/mL 接种到6孔板中，分组、给药及造模同2.4项，造模12 h后搜集细胞培养上清，严格按照试剂盒说明书进展操作，检测细胞培养上清中MDA含量、GSH及SOD活性。2.7 RTPCR检测Bcl2，Bax和caspase3 mRNA表达 分组、加药及造模同2.2项。每组设3个复孔。造模12 h后搜集细胞，应用Trizol试剂提取细胞总RNA

10、，逆转录合成cDNA，以beta;actin为内参进展扩增，检测细胞中Bcl2，Bax和caspase3 mRNA的表达量。Bcl2，Bax和caspase3 引物序列见表1。实验操作按试剂盒说明书进展。2.8 统计分析 所有数据均采用SPSS 17.0应用软件进展统计学分析。计量资料数据用plusmn;s表示，多组间比拟采用单因素方差分析，以P三、结果3.1 CCK8检测Lut对L02细胞活性的影响 为了寻找适宜的Lut反响浓度，本实验考察了Lut(2.5，5，10，20，40，80，160 mu;mol#12539;L-1) 对L02细胞活性的影响。研究发现Lut浓度在2.5，5，10 m

11、u;mol#12539;L-1时活性最强，故本实验采用2.5，5，10 mu;mol#12539;L-1的浓度梯度进展后续试验，见图1。3.2 APAP诱导L02细胞损伤模型的建立 本研究首先考察APAP浓度和刺激时间对L02细胞损伤的影响，结果显示随着APAP浓度的增加，L02细胞的存活率逐渐降低;随着造模时间的延长，一样APAP浓度下的L02细胞的存活率逐渐降低。综合考虑造模时间和造模浓度，以IC50为原那么，实验中12 mmol#12539;L-1APAP造模12 h的抑制率为(49.64plusmn;3.30)%，因此，本研究选择造模时间为12 h和造模浓度为12 mmol#12539

12、;L-1的APAP进展后续试验，见图2。3.3 Lut对APAP诱导L02细胞损伤的影响 形态学观察发现，对照组细胞生长良好、背景明晰，细胞贴壁结实，单个细胞呈扁平的梭形，透明度大、遮光性均匀;模型组(APAP，12 mmol#12539;L-1)细胞出现明显的凋亡，细胞数量减少，胞体缩小呈圆形。与模型组相比，Lut组和阳性药五味子乙素(Sch B)中的细胞状态明显改善，贴壁才能恢复明显，胞体增大，多数细胞呈梭形。从L02细胞形态变化上可见，Lut 在一定程度上可显著减轻APAP的损伤作用，进步细胞存活率，说明Lut对APAP损伤的L02细胞具有一定的保护作用，见图3。CCK8检测结果显示，模

13、型组中细胞存活率显著降低(P3.4 Lut 对L02细胞凋亡的影响 凋亡流式检测结果显示，与对照组相比，模型组(APAP，12 mmol#12539;L-1)细胞凋亡率显著升高(P3.5 木犀草素对APAP诱导的L02细胞中MDA，GSH及SOD的影响 实验结果显示，与对照组相比，APAP组MDA含量明显升高，而GSH和SOD活性明显降低(P3.6 Lut对凋亡相关基因Bcl2，Bax和caspase3表达的影响 实验结果显示，与对照组相比，APAP组Bax和caspase3 mRNA表达明显升高(P四、讨论近年研究说明Lut具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用。本研究通过建立APAP

14、诱导的肝损伤模型，讨论Lut对APAP诱导的L02细胞损伤的保护作用。APAP 诱导建立的肝损伤模型是目前较为常用的肝损伤模型，此模型造模时间短、易复制、稳定性好，是挑选保肝药物的理想模型1315。本实验发现，APAP(12 mmol#12539;L-1)能明显抑制L02细胞活性，Lut干预后，与模型组比拟，L02细胞活性明显改善，其中10 mu;mol#12539;L-1 Lut的药效最为明显。氧化应激在APAP诱导的肝损伤中起着重要作用16。MDA是脂质过氧化反响的产物，其上下常常可以反映脂质过氧化的程度，间接反映出细胞受自由基攻击的严重程度。SOD是平衡机体氧化与抗氧化的关键酶，能去除超

15、氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。SOD活性也是判断细胞损伤程度的相关指标。GSH可直接通过供H+拮抗氧自由基毒性，去除体内的超氧离子及其他自由基，防止肝细胞损伤。GSH 是机体内最重要的非酶性抗氧化物，其程度的多少是衡量机体抗氧化才能大小的重要因素。因此本实验测定三者程度来反映细胞氧化应激程度。本研究显示，与模型组相比，Lut组氧化指标MDA含量明显降低，抗氧化指标GSH和SOD活性那么显著进步(P氧化应激损伤可以引起细胞凋亡，本实验中细胞形态观察发现，与对照组相比，模型组细胞出现明显的凋亡，细胞数量减少，胞体缩小呈圆形;而Lut组细胞状态较模型组明显改善，贴壁才能恢复明显，胞体增大。CCK

16、8检测结果显示，模型组中细胞存活率显著降低(P细胞凋亡是一种由多种基因参与调控的程序性死亡的过程，现多种基因与细胞凋亡的信号转导相关，包括Bcl2家族基因(Bcl2，Bclxl，Bax，Bad等)，p53，Fas，FasL等都参与了凋亡的调控17。Bcl2家族基因能抑制或激活凋亡，其中Bax和Bad等基因可促进凋亡，而Bcl2和Bclxl等基因能抑制细胞凋亡18，Bax那么通过抑制Bcl2的活性诱导细胞凋亡19。caspase3属于半胱氨酸蛋白酶家族一员，在细胞凋亡中发挥重要作用。caspase3表达的增加、激活是外源性的死亡受体途径和内源性的线粒体途径凋亡信号通路共同的关键环节，因此是凋亡发

17、生的标志酶20。RTPCR结果显示，木犀草素是通过下调Bax和caspase3 mRNA及促进Bcl2 mRNA的表达而抑制APAP诱导的细胞凋亡。综上所述，木犀草素通过抑制氧化应激和细胞凋亡实现其对APAP诱导的L02细胞损伤的保护作用。其机制可能与抑制脂质过氧化，增强GSH和SOD活性，同时下调Bax和caspase3 mRNA及上调Bcl2 mRNA的表达有关，但详细机制还有待进一步讨论。参考文献1 Jaeschke H， Williams C D， Ramachandran A， et al. Acetaminophen hepatotoxicity and repair： the r

18、ole of sterile inflammation and innate immunityJ. Liver Int， 2022， 32： 8.2 Chun L J， Tong M J， Busuttil R W， et al. Acetaminophen hepatotoxicity and acute liver failureJ. J Clin Gastroenterol， 2022， 43： 342.3 Hinson J A， Roberts D W， James L P. Mechanisms of acetaminopheninduced liver necrosisJ. Han

19、db Exp Pharmacol， 2022， 196： 369.4 Bauer I，Vollmar B，Jaeschke H，et al. Transcriptional activation of heme oxygenase1 and its functional significance in acetaminopheninduced hepatitis and hepatocellular injury in the ratJ.J Hepato，2000，33(3)：395.5 Jaeschke H. Reactive oxygen and mechanisms of inflamm

20、atory liver injuryJ. J Gastroenterol Hepatol，2000，15(7)：718.6 Jaeschke H，Knight T R，Bajt M L. The role of oxidant stress and reactive nitrogen species in acetaminophen hepatotoxicityJ.Toxicol Lett，2022，144(3)：279.7 Song Z，Mc Clain C J，Chen T.SAdenosylmethionine protects against acetaminopheninduced

21、hepatotoxicity in miceJ.Pharmacology，2022，71(4)：199.8 Seelinger G，Merfort I，Schempp C M.Antioxidant，antiinflammatory and antiallergic activities of luteolinJ.Planta Med，2022，74(14)： 1667.9 Wu W，Li D，Zong Y，et al.Luteolin inhibits inflammatory responsesvia p38/MK2/ TTPmediated mRNA stability J. Molec

22、ules，2022，18(7)： 8083.10 Kapoor S. Luteolin and its inhibitory effect on tumor growth in systemic malignanciesJ.Exp Cell Res，2022，319(6)： 777.11 Cheng W Y，Chiao M T，Liang Y J，et al. Luteolin inhibits migration of human glioblastoma U87 MG and T98G cells through down regulation of Cdc42 expression an

23、d PI3K/AKT activityJ. Mol Biol Rep，2022，40(9)： 5315.12 李丽波，高涵，孙超，等.五味子乙素诱导的HSP27和HSP70对小鼠肝损伤的保护作用J. 齐齐哈尔医学院学报，2022， 31(8)： 1177.13 Tai M， Zhang J， Song S， et al. Protective effects of luteolin against acetaminopheninduced acute liver failure in mouseJ. Int Immunopharmacol， 2022， 27(1)： 164.14 Bajt M L， Knight T R， Lemasters J J， et al. Acetaminopheninduced oxidant stress and cell injury