荧光PCR系列产品操作培训ppt课件

1、荧光PCR系列产品 操作培训 一、实时荧光PCR平台简介二、荧光PCR系列产品操作细节三、荧光PCR异常结果分析一、实时荧光PCR平台简介传统PCR & 实时荧光PCR实时荧光PCR 常用荧光标志荧光染料SYBR Green ISyto 9荧光探针TaqManTaqMan-MGBTaqMan水解探针作用机理探针与目的序列配对光能量转移Taq游离的探针，无荧光。荧光基团 荧光淬灭基团 延伸时，Taq酶水解探针，使报告基团和淬灭基团分别而发出荧光，构成荧光信号。Taq发出荧光光实时荧光PCR 实验原理采用特异性引物，结合特异性的TaqMan荧光标志探针技术，经过荧光PCR仪，进展同步核酸扩增与检测

2、。 扩增曲线 四个阶段基线 阈值 Ct值 【DNA】0基线：扩增曲线的程度部分基线空白信号的产生是由于丈量的偶尔误差引起的默许前15个循环信号作为荧光本底信号 对数图谱线性图谱基线 阈值 Ct值 【DNA】0默许阈值=基线背景信号规范偏向 10缺省设置：3-15个循环的荧光信号的规范偏向的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值进入指数期的最初阶段基线 阈值 Ct值 【DNA】0Ct值：每个样本荧光信号到达设定域值时所阅历的循环数基线 阈值 Ct值 【DNA】0每个样本的Ct值与该样本的起始拷贝数【DNA】0的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。起点定量 & 终点定量起始

3、DNA量：样本中原有的量，更有意义；终点DNA量：经PCR过程加工，不是研讨所需求的数据；起点定量误差小，终点定量误差大。二、荧光PCR系列产品操作细节HPV系列产品13种高危型HPV检测试剂盒 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 不分型14种高危型HPV检测试剂盒 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 对HPV16、18分型样本类型&采集方法宫颈零落细胞 用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈零落细胞。男性尿道标本 用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞

4、，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检采集标本前2小时禁小便。男女性疣体标本 既可以直接切下疣体组织放进无菌玻璃管内，又可以用一次性注射器把疣体刺破后再用棉拭子反复擦拭病灶处零落细胞置入无菌玻璃管，密闭送检。特殊样本 TCT采集系统样本：可以运用，但可根据所剩细胞浓度 竞品采样系统样本：亚能、港龙等采样系统样本均可用，HC2采样系统要确保未经过处置方可运用采样前本卷须知不可在碘实验和醋酸实验之后采集样本。 能够会抑制PCR反响检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。 能够会呵斥假阴性 能够会抑制PCR反响检查前48小时不应有性生活。能够会呵斥假阳性月经期不可采集标本。防止血液

5、过多，能够会抑制PCR反响留意防止交叉污染。能够会呵斥假阳性样本保管样本采集后，如假设不能马上检测，应将样本置于冰箱4存放，并在一周时间内检测。应防止反复冻融。一周后检测的标本应保管在-20 。DNA提取 取800ul样本离心得沉淀 参与细胞裂解液50ul，煮沸10min 12000离心10min即可上机假设肉眼未见沉淀，可添加取样量，再次离心搜集沉淀；假设沉淀杂质较多，可用细胞保管液洗涤1-2次；血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次；粘液多样本，取样时尽量去除粘液。应留意防止爆盖：金属浴可压重物冰盒、冰袋等水浴应采用螺旋管盖的离心管确保离心管质量合格优点：简单、快捷、方便。缺陷：HPV DNA纯

6、度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。针对男性样本或女性疣体样本棉拭子样本，先用细胞保管液/生理盐水洗脱，搜集沉淀，而后与上述操作一致DNA质量要求匹基、达安等都是运用直接煮沸法提取的DNA， 可直接运用运用过柱法试剂盒，比如QIAGENE提取的DNA，也可以运用PCR试剂配制HPV13荧光 PCR MIX（l） Taq 酶（l） DNA 模板（l）1人份量 17.5 0.5 2/人份10人份量 1755 2/人份HPV12+2 PCR MIX（l） Taq 酶（l） DNA 模板（l）1人份量 17.5 0.5 2/人份10人份量 175 5 2/人份按样本数参与所需溶液的对应量，充

7、分混匀再分装对照设置定性实验 每次实验都必需设置阴阳性对照定量实验 个别医院要求定量结果，需添加规范品105、106、107、108 copies 规范品普通可以反复冻融3-4次，超越5次，那么不建议运用 规范品置于-20中保管操作本卷须知PCR试剂保管配制PCR试剂应放于-20避光保管PCR试剂应防止反复冻融试剂配制时不能佩戴有粉手套PCR mix与Taq酶充分混匀加模板时应防止吸到沉淀 漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较平安切勿在PCR管上做标志，但应留意样本顺序上机前应离心去除气泡规范品加样时应尽量防止加样误差，影响规范曲线仪器检测通道选择HPV13荧光 报告荧光 淬灭荧光13种高危型

8、FAM NoneHPV12+2 报告荧光 淬灭荧光12种高危型FAM NoneHPV16HEX/JOENoneHPV18ROX/Red 610None-globin Cy5 NoneSTD系列产品CT/NG/UU结合检测试剂盒淋球菌核酸检测试剂盒沙眼衣原体核酸检测试剂盒解脲脲原体核酸检测试剂盒样本类型&采集方法宫颈零落细胞 用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈零落细胞。泌尿生殖道标本 用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检采集标本前2小时禁小便。样本保管样本采集后，如假设不能马上检测，应将样本置于冰箱4存放，并在一周时

9、间内检测。应防止反复冻融。一周后检测的标本应保管在-20 。棉拭子样本应在真空管中保管，要操作前再加生理盐水/细胞保管液进展洗脱。DNA提取 取800ul样本离心得沉淀 参与细胞裂解液50ul，煮沸10min 12000离心10min即可上机假设肉眼未见沉淀，可添加取样量，再次离心搜集沉淀；假设沉淀杂质较多，可用细胞保管液洗涤1-2次；血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次；粘液多样本，取样时尽量去除粘液。应留意防止爆盖：金属浴可压重物冰盒、冰袋等水浴应采用螺旋管盖的离心管确保离心管质量合格优点：简单、快捷、方便。缺陷：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。针对泌尿生殖道样本

10、棉拭子样本，先用细胞保管液/生理盐水洗脱，搜集沉淀，而后与上述操作一致PCR试剂配制 PCR MIX（l） Taq 酶（l） DNA 模板（l）1人份量 17.5 0.5 2/人份10人份量 1755 2/人份按样本数参与所需溶液的对应量，充分混匀再分装对照设置定性实验 每次实验都必需设置阴阳性对照定量实验 个别医院要求定量结果，需添加规范品105、106、107、108 copies 规范品普通可以反复冻融3-4次，超越5次，那么不建议运用 规范品置于-20中保管操作本卷须知PCR试剂保管配制PCR试剂应放于-20避光保管PCR试剂应防止反复冻融试剂配制时不能佩戴有粉手套PCR mix与Ta

11、q酶充分混匀加模板时应防止吸到沉淀 漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较平安切勿在PCR管上做标志，但应留意样本顺序上机前应离心去除气泡规范品加样时应尽量防止加样误差，影响规范曲线仪器检测通道选择单一微生物 报告荧光 淬灭荧光NG/CT/UUFAMNone-globinHEX/JOE NoneCT/NG/UU联合 报告荧光 淬灭荧光CTFAM NoneNGHEX/JOENoneUUROX/Red 610None-globin Cy5 None乙肝病毒定量产品对临床血清标本中的乙型肝炎病毒HBV核酸DNA的定量检测样本类型&采集方法血清样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于无菌搜集管中，室

12、温放置不超越4 h， 1500 rpm离心5 min，汲取血清转入1.5 ml离心管中备用。血浆样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于含有EDTA作为抗凝剂的无菌搜集管中，室温放置不应超越4 h，1500 rpm离心5 min，汲取血浆转入1.5 ml离心管中备用样本保管样本采集后，如假设不能马上检测，应将样本置于冰箱2-8存放，并在72h内检测-20保管不超越3个月-70下长期保管应防止反复冻融DNA提取 1取200ul样本于1.5ml离心管中血清/血浆/阴阳质控品/阳性规范品)；2参与20ul蛋白酶K；3参与200ul溶液L，混匀，56温浴10-15min；4参与200ul无水乙醇

13、，充分混匀；5将全部液体转移至带搜集管的硅胶柱中；610000rpm离心1min，弃废液；7参与500ul溶液W1确保已参与乙醇；810000rpm离心1min，弃废液；9参与500ul溶液W2确保已参与乙醇；1010000rpm离心1min，弃废液；11参与500ul溶液W2确保已参与乙醇；1210000rpm离心1min，弃废液；13空管离心，12000rpm离心3min，丢弃搜集管；14将硅胶柱装入新1.5ml离心管中，开盖1-2min；15往硅胶柱中心参与60-200ul的TE，静置3-5min；1612000rpm离心2min，弃柱得DNA。提取前，应将HBV内标参与到裂解液中溶液L

14、：HBV内标=200 l：0.5l温浴后，加样前应点动离心乙醇可提取放于冰箱，低温可提高DNA的沉降效率样本管编号与硅胶柱编号应一一对应TE可提早预热，但温度不宜过高，可提高DNA的洗脱效率硅胶柱编号与新离心管编号应一一对应PCR试剂配制PCR MIX（l） Taq 酶（l）UNG酶（l） DNA 模板（l）1人份量 19.2 0.60.220/人份10人份量1926220/人份按样本数参与所需溶液的对应量，充分混匀再分装对照设置定量实验每次实验均需设置一个强阳性对照、一个临界阳性对照、一个阴性对照加样顺序为待测样本DNA、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照、对照上清液、阳性任务规范品1-45

15、106 IU/ml、5105 IU/ml、5104 IU/ml、5103 IU/ml操作本卷须知PCR试剂保管配制PCR试剂应放于-20避光保管PCR试剂应防止反复冻融试剂配制时不能佩戴有粉手套PCR mix与Taq酶/UNG酶充分混匀加模板时应留意加样量的准确性，减少定量的操作误差切勿在PCR管上做标志，但应留意样本顺序上机前应离心去除气泡仪器检测通道选择HPV定量 报告荧光 淬灭荧光HBVFAM None内标HEX/JOENone整体操作流程DNA提取PCR试剂配制、加样样本采集结果分析上机扩增结果分析设置基线以ABI仪器为例假设有Ct16的强阳性样本，将此样本定为强阳性，并将此样本从数据

16、库中剔除，然后以3-15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct值；假设该样本需进展定量，那么将其稀释后再重新扩增 ；假设无Ct16的强阳性样本，应选3-15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct值。设置阈值线 基线和阴性对照的上方，同时保证在指数增长期内整体扩增曲线察看整体扩增曲线平滑 阴性对照、阳性对照结果正常弱阳性样本拐点明显每个样本的内质控曲线察看：假设无内质控曲线，应察看能否有其他型别阳性曲线；均无曲线，那么该样本扩增无效，需复查假设有规范曲线，两两规范曲线之间等间隔，高低值规范品的Ct值能否在正常范围内，察看回归系数、斜率、截距等参数结果分析三、荧光PCR异常结果分析扩增曲线规范曲线原始数据常见缺点排除异常扩增曲线基线设置能否正确 基线校正 基线开场值 基线终止值阈值设置能否正确 设置在指数增长期 自动或手动设置扩增曲线出现交叉多引物、多探针反响体系中，每个类型的扩增效率不一致到导致样本本身的缘由导致荧光曲线的差别 扩增曲线平台期低样本浓度问题引物二聚体或浓度问题扩增曲线指数增长期异常无指数增长期？指数增长期较短？扩增曲线不光滑样本信号值太弱，点与点之间的差距被放大扩增时间开场较晚，定量不准确 扩增曲线呈直线上升部分探