第十四章临床遗传

1、Clinical genetics第十四章 临床遗传运用医学遗传学理论知识，通过家系调查和各项临床检查来诊断、治疗和预防遗传病。遗传病的诊断遗传病的治疗遗传病的预防Clinical genetics遗传病的诊断(diagnosis)诊断的类型及手段 临症诊断 症状前诊断 出生前诊断（产前诊断） 着床前诊断基因诊断临症诊断(Symptomatic diagnosis)遗传病临床症状出现后所作的诊断。一般手段： 病史、症状、体征、常规的实验室检查特殊手段： -系谱分析 -核型分析：染色体分析 -生化分析：酶水平、代谢产物等 -DNA分析：PCR 、 RFLP 、测序 症状前诊断 (presympt

2、omatic diagnosis)在某些遗传病(如Huntington舞蹈病)可疑杂合子个体生育之前作出的诊断。家系调查和系谱分析基因诊断,见后出生前诊断(prenatal diagnosis)以羊膜穿刺和绒毛取样术为主要手段，对羊水细胞及绒毛细胞进行遗传学分析，以判断胎儿的染色体或基因是否正常。出生前诊断的对象1、35岁以上的高龄孕妇；2、夫妇之一有染色体病；3、夫妇之一有单基因遗传病；4、夫妇之一有先天畸形者；5、曾生育过遗传病患者；6、有习惯性流产史；7、夫妇之一受到致畸因素影响；8、夫妇之一为遗传病携带者。出生前诊断的途径和方法羊膜穿刺：1418周 比较绒毛取样术：79周脐带穿刺术：1

3、8周胎儿镜检查：1518周超声诊断仪检查：任何时候X线照相术：16周从母血中分离胎儿细胞：1216周着床前诊断(preimplantation diagnosis)胚胎着床前对处于卵裂期的胚胎进行检测，从而判断胚胎是否携带有致病基因。取样时间：第3天胚胎或第5天囊胚。辅助生殖时需采用。存在伦理学问题需解决。基因诊断(gene diagnosis)定义：通过检测遗传病患者的DNA或mRNA作出诊断。基因诊断的策略：1）从基因产物入手作诊断2）从基因定位入手作诊断3）从比较正常和异常基因的差异入手作诊断已知基因、已知突变的检测等位基因特异性寡核苷酸杂交分析(allele-specific olig

4、onucleotide, ASO)：探针杂交基因芯片(gene chip)技术：快速、高效、敏感、经济、平行化和自动化DNA测序法（DNA Sequencing）：为最基本和最重要的实验手段 PCR-ASO分析MELAS糖原累积症突变基因检出 III2第727位测序结果 III2第1071位测序结果abI2第727位测序结果 I2第1071位测序结果 cdDNA或RNA序列分析Gilbert发明的化学测序法和Sanger发明的双脱氧终止测序法。以凝胶电泳为基础的DNA自动测序仪和以毛细管电泳为基础的DNA自动测序仪。以Roche/454、ABI/SOLiD和Illumina/Solexa为代表

5、的新一代高通量测序技术（第二代测序）的应用已实现了“10万美元基因组”的目标。“下一代测序技术（第三代测序）” 将实现“1001000美元基因组”的目标。限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoreris, DGGE) 单链构型多态性(single-strand conformational polymorphism, SSCP) 变性高效液相色谱检测(denaturing high performance liquid chrom

6、atography, DHPLC) 检测已知基因、未知突变限制性片段长度多态性(RFLP) ：Lane 1 shows the markers. Lanes 2,5 and 8 show negative control. Lanes 3, 6, and 9 also show control. Lanes 4, 7, and 10 have evidence of gene rearrangement. Lane 11 is a 5% sensitivity control.RFLP用于苯丙酮尿症的基因诊断根据异源双链DNA与同源双链DNA解链特性的不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区

7、的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，表现为双峰或多峰的洗脱曲线。变性高效液相色谱检测(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)HomoduplexesHeteroduplexes未知基因、未知突变分析候选基因法（传统法）：选择与遗传病相关联的已知基因作为候选基因，通过家系调查和连锁分析，确定易感/致病基因。外显子捕获或测序技术(exome capture or sequencing)：用于定位单基因遗传病的致病基因及多基因遗传病的易感基因。全基因组扫描法：用于定位多基因/多因素遗传病的易感基因。标记= 0

8、.00= 0.10= 0.20= 0.30= 0.40D6S289-1.6817360.6964850.7777310.4655420.106374D6S1584-2.8884930.5609760.7286710.5017100.180457D6S422-0.8024740.1721580.3528480.2077980.031536D6S16910.4354981.5716981.2816750.7502940.231349D6S2763.8821253.0591172.1039981.1426860.357661D6S16182.0022782.0055581.5316980.89542

9、60.296443D6S1568-0.1008271.0760880.8411140.4241310.087045D6S2910.6325031.8146341.3696840.7601810.237437D6S1610-1.4724101.0112360.8772290.4412640.060830D6S1562-0.5674010.7903470.5790430.2885420.060859D6S1575-3.2311820.1508540.4412590.2990270.076821强直性脊柱炎的连锁分析外显子组捕获技术外显子组捕获(exome capture and sequencin

10、g )技术通过全外显子组扫描，并结合生物信息分析技术，以寻找遗传病患者特有的SNP及单基因病的致病基因。技术平台：罗氏公司推出的Nimblegen外显子捕获平台；安捷伦科技公司推出的SureSelect 平台。Ng等利用外显子测序方法发现的导致米勒综合征致病基因（未知病因遗传病的致病基因）。采用外显子捕获技术已发现了近百种遗传病的致病基因。 GWAS定位多基因病的易感基因全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)是指在全基因组层面上，开展多中心、大样本、反复验证的SNP与疾病的关联研究，以揭示遗传病的相关基因。Stahl等应用GWAS法识别了7个

11、新的类风湿性关节炎的易感基因，包括IL6ST, SPRED2, RBPJ, CCR6, IRF5, PXK和AFF3。GWAS的优点：效率高，重复性强，且适用于不同种族。已有1300余篇采用GWAS方法定位了200余种多基因遗传病及肿瘤易感基因的论文发表。遗传病的治疗(treatment)常规治疗单基因病的治疗 禁其所忌、去其所余、补其所缺多基因病的治疗外科手术、药物或二者并用染色体病的治疗性染色体病：补充激素常染色体病：对症治疗上海市12种可治性罕见遗传病的患病率及治疗方法疾病患病率治疗方法患者数/年苯丙酮尿症（含四氢生物蝶呤缺乏症）1:1.1万低苯丙氨酸饮食/奶粉，补充BH4，L-多巴、5

12、-羟色氨1016人枫糖尿症1:20万限亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸饮食,补充维生素B10-1人酪氨酸血症1:20万低苯丙氨酸、酪氨酸饮食，补充1,3-环已二酮0-1人甲基丙氨酸血症1:3.5万限亮氨酸/缬氨酸/甲硫氨酸饮食，补充肉碱、维生素B12、甜菜碱4-5人多种羧化酶缺陷病1:6万生物素1-3人高氨血症1:5万饮食治疗，补充精氨酸、瓜氨酸、苯甲酸钠1-2人肝豆状核变性1:5万低铜饮食，青霉胺治疗3-4人先天性耳聋1:1万人工耳蜗，助听器15-20人戈谢病1:20万酶替代治疗，Cerezyme0-1人法布雷病1:20万酶替代治疗，Fabrazyme0-1人粘多糖病1:10万酶替代治疗，Aldur

13、azyme1-2人糖原累积症II型1:20万酶替代治疗，Myozyme1-2人基因治疗(gene therapy)定义：应用DNA重组技术，替代、校正或增补患者细胞中有缺陷的致病基因，恢复这些基因的正常功能，以达到治疗遗传病的目的。种类与策略： 种类：体细胞与生殖细胞两大类 策略：基因修正、替代、开放、抑 制、免疫基因等。基因治疗步骤靶细胞的选择：干细胞为首选目的基因的克隆目的基因的转移：活体直接转移(in vivo)、在体转移(ex vivo)。方法包括物理、化学和生物法（主要是病毒介导）目的基因的表达: 在重组病毒上装上启动子(promoter)或增强子(enhancer)等调控因子。安全

14、措施：保证转移-表达系统的绝对安全。三种病毒载体特点的比较特点逆转录病毒慢病毒腺病毒病毒基因组RNA病毒RNA病毒双链DNA病毒能插入的最大目的基因7.07.5 kb7.07.5 kb30 kb基因转移途径Ex vivoEx/in vivoEx/in vivo是否整合到宿主基因组中是是否感染细胞类型分裂细胞分裂/不分裂细胞分裂/不分裂细胞目的基因在体内表达时间短长短引起宿主免疫反应的程度低低高是否可更换特异启动子不需要可以可以是否会导致插入位点突变会会不会能否得到转基因动物模型较难可以不能Gene therapy年份项目数各国政府批准的项目类型受试人数肿瘤基因标记遗传病艾滋病心血管病其他199

15、62360-2510-153719972125834348.51.4-2000199938769.26.99.112.6-2.23278各国1996-1999年间基因治疗临床试验项目统计数基因治疗举例腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症(AR或XR)：患者出现重症联合免疫缺陷病(SCID)，首例ADA基因治疗家族性高胆固醇血症：LDLR基因治疗胰囊性纤维化：CFTR基因治疗血友病B：F:IX基因治疗肿瘤： 免疫效应细胞等；细胞因子等；抑癌基因转移肿瘤细胞等；封闭或切割癌基因等。Gene therapy for first patientAshanti Desilva who affectedSCID i

16、n 1990基因治疗的失败案例1999年宾夕法尼亚大学的科学家开展了鸟氨酸转氨甲酰酶(ornithine transcarbamylase, 简称OTC)缺陷症的基因治疗。该病患者因缺乏OTC基因的正常拷贝，抑制了机体对氨的清除作用。受试者是年仅18岁的JesseGelsinger（来自美国亚利桑那州）的学生。科学家构建了减毒腺病毒和感冒病毒毒株，并以此为载体将正常拷贝的OTC基因导入到患者肝脏。因腺病毒感染导致多器官衰竭(multiorganfailure)而不幸离世。而法国发生的SCID-X1（严重联合免疫缺陷）患者接受基因治疗后患上白血病，是因为逆转录病毒载体插入到造血系统原癌基因LMO

17、2启动子附近从而将LMO2激活所致。 近年基因治疗成功案例疾病疾病类型受益病人数首次发表年代X-SCID免疫缺陷症17/202000ADA-SCID免疫缺陷症26/372002肾上腺脑白质营养不良神经系统疾病2/42009Leber氏先天性黑矇全盲28/302008威-奥二氏综合征免疫缺陷症8/102010b地中海贫血症血红蛋白病1/12010血友病凝血疾病6/62011造血干细胞基因治疗b地中海贫血症遗传病的预防继发性预防(secondary prevention)带有某种致病基因的个体在出现临床表现之前所作的预防。如出生前筛查、新生儿筛查、携带者检出等。原发性预防(primary prev

18、ention)异常基因型出现以前所作的预防。如遗传咨询等。遗传咨询类型前瞻性遗传咨询回顾性遗传咨询强制性遗传咨询指令性遗传咨询教育性遗传咨询/非指令性遗传咨询遗传咨询对象未婚青年的婚姻指导： 一方或双方的家庭里可能有遗传病患者，近亲婚配？已婚夫妇的生育指导： 一方或双方的家庭里有遗传病患者，或该夫妇已出生过遗传病患儿。遗传咨询步骤 明确诊断 家系调查和分析遗传方式 估计再显危险率：高、中、低三级 婚姻和生育指导避孕或绝育：10%禁止结婚：见婚姻法存在一定风险的咨询对象生育遗传病患者风险很小或病情很轻的咨询对象希望领养、或辅助生殖的咨询对象 制订防治措施、定期随访单基因病再显危险率的估计亲代基因

19、型能推定AD: Aaaa 1/2AR: Dd Dd 1/4 2/3(杂合子)XD: XH YXhXh, XhY XHXhXR: XDY XDXd亲代基因型能推定时再显风险估计Recurrence risk of single-gene disorders Genotype of the couple being disclosedMode of inheritanceMating typeSeg. Freq. among progenyNormalCarrierAffectedADAaaa1/2-1/2AaAa1/4-3/4ARAAaa-1-Aaaa- 1/21/2AaAa1/42/41/4

20、Segregation frequencies among progeny under X-linked inheritanceMode of inheritanceMating typeSeg. freq. among progenyMaleFemaleNormalAffectedNormalAffectedCarrierXDXHYXX1-1-XYXHX1/21/21/21/2-XRXhYXX1-1XYXhXh-1-1XYXhX1/21/21/2-1/2XhYXhX1/21/2-1/21/2亲代基因型能推定时再显风险估计有信息提供能否定亲代是杂合子的证据如血友病A (XR)家系：亲代基因型不

21、确定时再显风险估计Bayes逆概率定理前概率(prior probability)：按孟德尔分离律得出的理论概率。条件概率(conditional probability)：在某种特定遗传假设的条件下，产生该特定情况的概率。联合概率(joint probability)：前概率与条件概率所说明的两个事件同时出现的概率。后概率(posterior probability)：是一个相对概率。是在假设特定的条件下，某一联合概率在所有联合概率中所占的比率。血友病家系(XR)概率II-5为HHII-5为Hh 前概率1/21/2条件概率14=1(1/2)4 = 1/16联合概率16/321/32后概率16

22、/171/17血友病家系(XR)III-2为杂合子机会为1/34III-1与III-2儿子得病风险1/341/2=1/68；子代1/136Huntington舞蹈病家系(AD)43岁以前的发病风险为64%，25岁以前的发病风险为8%Huntington舞蹈病家系(AD)概率II-2为UuII-2为uu 前概率1/2=0.51/2=0.5条件概率1-0.64=0.361联合概率0.180.5后概率0.260.74Huntington舞蹈病家系(AD)概率III-1为UuIII-1为uu 前概率 0.130.87条件概率1-0.08=0.921联合概率0.120.88后概率0.120.88III-

23、1目前的发病风险为0.12酪氨酸血症家系(AR)概率III2为HHIV2当然为HHIII2为HhIII2为HhIV2可能为HHIV2可能为Hh前概率(1/2)(1)=1/2(1/2)(1/2)=1/4(1/2)(1/2)=1/4条件概率12=112=1(1/2)2=1/4联合概率(1/2)(1)=8/16(1/4)(1)=4/16(1/4)(1/4)=1/16后概率8/134/131/13再生一胎风险为1/131/2=1/26Hurler综合征家系(AR)Hurler综合征家系(AR)概率II-2和II-3为杂合子其它组成 前概率2/97/9条件概率(3/4)2=9/161联合概率9/7256

24、/72后概率9/6556/65(9/65)(1/4) = 9/260染色体病再显危险率的估计亲代核型均正常：就是群体发病率双亲之一为染色体平衡易位携带者或嵌 合体，子代的再显危险率就较高。如母亲的核型为45,XX,-14,-21,+t(14q21q)其生殖细胞可有6种类型： 22,X,-14,-21,+t(14q21q) 23,X 23,X,-14,+t(14q21q) 22,X,-21 23,X,-21,+t(14q21q) 22,X,-1414与21平衡易位携带者子代的再显危险率染色体病再显危险率的估计如与正常的男性生殖细胞（23,X)受精后可出现下列情况：46,XX 正常45,XX,-1

25、4,-21,+t(14q21q) 携带者46,XX,-21,+t(14q21q) 很少成活45,XX,-14 致死45,XX,-21 致死46,XX,-14,+t(14q21q) 易位型21三体21三体综合征的再显危险率患者核型父亲母亲再显危险率D/G易位正常携带者0.100.15携带者正常0.0521/21易位正常携带者1.00携带者正常1.0021/22易位正常携带者0.100.15携带者正常0.0521三体型正常正常0.01嵌合体正常正常小多基因病再显危险率的估计多基因遗传病的再显危险率是由遗传因素、环境因素共同作用决定的。因此只能通过群体发病率和家系中受累者的多少来加以估计。见表14-

26、17。Edwards公式：qr = qg（h2=70%80%, qg=0.1%1.0%）出生前筛查 通过测定母体血清和羊水甲胎蛋白(AFP) 筛查胎儿神经管缺陷。遗传筛查(genetic screening)遗传筛查(genetic screening) 对35岁以上的孕妇，通过羊水细胞或 绒毛膜细胞的检查，以筛查胎儿的染色体 畸变，如DOWN综合征。新生儿筛查 在新生儿期对一些遗传病进行群体筛查。 如苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能减退症、 先天性耳聋等。Guthrie细菌生长抑制试验检测新生儿血液中苯丙氨酸水平新华医院遗传性代谢病的筛查和诊治体系新生儿疾病筛查中心遗传性代谢病诊治中心产院新生儿

27、筛查标本全国遗传性代谢病检测协作网标本美国CDC、卫生部质控遗传性代谢病DNA库遗传性代谢病的诊断技术平台串联质谱检测GC-MS检测HPLC检测酶学测定基因诊断临床治疗与随访遗传筛查(genetic screening)携带者检出携带者：表型正常，但带有某种致病基因或异常染色体的个体。AR遗传病的杂合子个体XR遗传病的杂合子女性AD遗传尚未外显的杂合子个体染色体平衡易位的携带者个体线粒体基因病表现型正常的杂质携带者等遗传登记和随访遗传登记(genetic register) 是指某一地区的遗传保健服务机构对该地区某些严重的遗传病家系进行登记的一项工作。遗传随访(genetic follow-u

28、p) 是对已确诊的遗传病患者及其家属作定期的门诊检查或家访，以便动态地观察患者及其家属各成员的变化情况，同时给予必要的医疗服务。遗传保健(Genetic care)遗传保健 是遗传病最根本的原发性预防。 它是指正常人群通过自身保护或医疗卫生来避免和防止遗传病的发生。防止环境污染纠正不良生活习惯：吸烟、酗酒等Healthy living style4 Nos living style No smoking; No excessive drinking No mould food; No sexual life when drunk4 Lows living style Low salt; Low sugar Low fat; Low cholesterol临床遗传服务中的伦理原则遗传服务(genetic service) ：也是一种医学服务，它是将遗传学的知识和技术应用于解决人类自身的生、老、病、死的问题。因此，是一种应用遗传知识和技术的医学实践。遗传伦理学(genetic ethics)是规范遗传服务中人与人之间的关系和行为的学科。 临床遗传服务的内容 按照遗传咨询的要求，与病人及其家属进行谈话，并提供防治意见和婚育建议；按照遗传病特殊检查的指证，给患者进行染色体检查或基因检测，以明确诊断；根据基因治疗的原则，给有条