XXXX年 分子生物学实验(1)ppt课件

1、分子生物学实验实验一 DNA重组实验 . 要 求1、实验室内制止饮食、勿高声说话、随意走动。2、课前预习、课中仔细操作和课后的实验报告。3、妥善保管好每组的实验器具。4、实验操作要求人人动手。5、每次实验终了要验加样枪的准确性，然后做好值日卫生任务。.第3周DNA重组实验 第4周原核表达蛋白的SDS电泳分析 第5周Western Blotting I 第6周Western Blotting II .时间分配实验内容10:00-10:30酶切加样10:30-12:3037酶切；原理讲述12:30-13:30回收13:30-14:00连接加样14:00-16:0025连接；休息16: 0-16:3

2、0转化16:30-17:3037孵育培养；倒平皿17:30-18:00涂布. 学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的衔接，将T载体上所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到表达载体上。一、实验目的二、实验原理 限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处置后用于衔接反响；选择表达载体pET28a多克隆位点上相应的限制性内切酶切割；在衔接酶的作用下将外源片段衔接到载体上，实现外源片段的克隆。.实验资料： 外源片段DNACHY基因的PCR产物； 载体pET28a-egfp含有绿色荧光蛋白DNA片段； BL21感受态细胞鼎国公司； 培育皿； 37摇床及培育箱。实验

3、试剂：限制性内切酶(EcoRI; XhoI) TaKaRa公司；T4 DNA衔接酶；LB液体培育基和固体培育基；卡那霉素kana:任务浓度100g/mL；氯仿/异戊醇24:1；无水乙醇；3M NaAc；70%乙醇；ddH2O。 三、实验资料与试剂凝乳酶.四、实验步骤 1载体pET28a-egfp和外源DNA片段的限制性酶切：50l反响体系，用1.5ml tube，冰上操作试剂加样量DNA5lEcoRI1lXhoI1l10buffer5lddH2O38l37反响1hr。分别取8l外源片段酶切产物和5l pET28a-egfp酶切产物于1.0%凝胶检测酶切能否完全；按2-5步纯化、回收DNA。2参

4、与ddH2O 200l扩展体积，参与等体积氯仿/异戊醇24:1，颠倒混匀，12000 g离心10 min；3汲取上清200l，加3M NaAc 15l和无水乙醇4 00l，-20放置15分钟以上；413000rpm 离心10分钟；5倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10l ddH2O1.5 ml tube中， pET28a-egfp溶于10l ddH2O1.5 ml tube中；.6衔接反响15l体系：试剂加样量CHY10 lpET28a-egfp2.5 l10buffer1.5 lT4 Ligase1 l25 30min7.取1只灭菌的EP离心管，a. 每管参与感受态悬液50

5、 ul及衔接产物或质粒50-100ng 15ul 无菌操作；b. 混匀不可以振荡，冰浴 30 min；c. 取出放入42C水浴中热休克90秒，不要摇动试管，迅速放入冰中，冰浴5min。d. 向每管中参与无抗生素的LB液体培育基400ul，该溶液称为转化反响液。混匀后，于37C100150rpm温暖摇振培育 60min，使细胞恢复正常生长形状，并表达质粒编码的抗生素抗性基因kanar。 .8.制备含有适当抗生素的LB培育基平板。9.挑选培育：取转化反响液200 l，均匀涂布于含有Amp抗性的LB培育基平板上。将涂布好的平皿置37C平放20 min，然后倒置培育12-16 h。期间应留意察看，当菌

6、落生长良好，而相邻菌落尚未相互重叠时，即停顿培育。假设发现菌落太多或太少时，应改动转化反响液的用量，重新涂布培育。 .1. 运用酶时应尽量减少其分开冰箱的时间，以免活性降低。酶通常保管在50%的甘油中，实验中，应将反响液中甘油浓度控制在1/10以下，否那么，酶活性将受影响。2. 吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应改换，不要相互污染试剂。3. 加试剂前，应短促离心10秒钟，然后再翻开管盖，以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。4. 防止杂菌和杂DNA的污染。整个操作过程均应在无菌条件下进展，所用器皿，如离心管，移液枪头等应是新的，并经高压灭菌处置。5. 离心操作一定要在低温下进展，所用

7、的水、Eppendorf管都要在冰上预冷，不能分开冰浴，否那么细胞转化率将会降低。6. 37振荡培育时间不宜过长，否那么会出现很多的卫星菌落和细微的菌膜干扰。7. 平板涂布重组体时，应防止反复来回涂布，由于感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂、死亡，影响转化效率。8. 涂布后培育时间不宜超越24h，否那么会出现卫星菌落。五、本卷须知.实验设定二组，1、宿主菌涂布；2、转化衔接产物的受体菌涂布。最后比较培育好的平皿，可以看到： 含抗菌素培育皿上的受体对照组并没有长出菌落，证明受体菌对抗菌素是敏感的，并证明在本实验中没有发生抗药性突变。 转化衔接产物的受体菌在含抗菌素的培育皿

8、中也长出了菌落，这不是受体菌的抗药性的自发突变株，一定是质粒DNA转入细菌后的转化体，这是由于带抗药性的质粒DNA转入细菌后，使转化体产生抗药性这一遗传特性的结果。六、结果察看及分析的原那么. 由于此实验过程涉及多个实验环节，如酶切、衔接、感受态细胞、转化等各方面的效率，因此在实验中经常会出现一些问题。如：1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否那么DNA溶液中其他成分会干扰酶反响。2.DNA浓度过低时可适当浓缩后再酶切，浓度过高能够酶切不完全可以适当稀释酶切。3.反响液中参与过量的酶是不适宜的，除思索本钱外，酶液中的微量杂质能够干扰随后的反响，假设底物DNA较多可以延伸酶反响时间。七、常见问题分析及处置.1.限制性酶切反响及