分子生物学实验课件：6重组克隆子的鉴定-菌落PCR

1、实 验 六重组克隆子的鉴定（菌落PCR技术）从本节课起，开始考察同学们的实验操作1. 无菌操作：酒精灯的合理使用，保持枪头盒，EP管盒的无菌，各种溶液不被污染。 2. 独立完成实验：不要随意走动串门，不要相互加各种溶液，不要让其他同学帮自己该做的实验。3. 及时做好标记：标记规范合理，不要搞错样品和材料。4. 及时改正错误：对于某些操作的错误，及时改正。5. 合理规范使用实验器材：包括移液器，各种仪器等。 实验管(1#,2#,3#) 阴性对照管(-) ddH2O 17.5L 17.5L 10 xbuffer 2.5 L 2.5 L 2.0mMdNTPs 2.0 L 2.0 L Primer1

2、1.0 L 1.0 L Primer 2 1.0 L 1.0 L Template DNA (细枪头粘菌) Taq 1.0 L 1.0 L 反应总体积 25 L 25 L在0.2ml Ep管(标记)中建立254=100l 反应体系，再分装到PCR小管中，最后加不同的模板DNA（菌），混匀。细枪头粘菌：镊子取细枪头,枪头粘1个菌落,然后置入EP管,用手转动枪头几圈,弃枪头。(在平板上做好标记)循环扩增：按下述程序进行扩增 95 预变性 5 min 94 变性 45 sec 50 退火 45 sec 72 延伸 45 sec 72 延伸 5 min 30 cycles背景理论知识Section 1

3、重组子鉴定可从以下水平进行：DNA水平： 快速抽提酶切分析 原位杂交 Southern杂交 DNA顺序分析 PCR检测mRNA水平： RNA杂交 反转录-PCR蛋白质水平：免疫沉淀检测法功能水平： 抗性反应 显色反应 PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖6.1.1 实 验 目 的学习PCR体外扩增DNA原理及引物设计的原则掌握PCR的基本操作步骤学习和掌握菌落PCR检测重组克隆子的方法了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响 聚合酶链式反应P

4、olymerase Chain Reaction, PCR 在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增一段目的基因的技术。6.1.2【实验原理】以单链DNA为模板、4种dNTP为底物,在模板3末端引物存在的条件下,利用酶进行互补链的延伸。经变性、退火和延伸多次循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。6.1.2【实验原理】 模板DNA 引物:与被分离的目的基因两条链各自5端 序列相互补DNA（20个左右碱基的短DNA单链) TaqDNA聚合酶 dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP） 反应缓冲液典型PCR反应体系的组成6.1.2【实验原理】变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分

5、引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板,合成互补的新DNA链 (延伸时间：1kb/min)每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得 230(1.07109)个基因片段6.1.3 PCR方法发展传统的PCR定量PCR(测定mRNA含量)半定量PCR (RT-PCR)反向PCR(扩增未知序列) 巢式PCR定点诱变和DNA测序分析的PCR技术基础研究遗传病家系分析传染病诊断古生物及进化分析法医鉴定和考古学研究6.1.4 PCR方法应用6.1.5 成功PCR的特点特异性：高度特异地产生一个扩增带有效性：高效率，较少的循环获得较多的 扩增产物忠实性：体

6、现在由DNA聚合酶诱导的错配率非常低两个关键一、正确的引物设计引物长度和GC%含量 15-60 bp，40%-60%Tm值： Tm=4(G+C)+2(A+T ) Ta=Tm - 5引物的端部 3端起始碱基决定特异性，错配延伸效率 TG=CA 5端碱基可呈游离状态，可被修饰（如加酶切位点，引入突变位点，插入启动子序列等） 4. 引物无回文对称结构（发夹结构）5. 引物自身不能配对 5-AGCT3 3TCGA-5 引物二聚体（反应底物，与靶序列竞争酶和dNTP）6. 二引物间不能配对7. 二引物的Tm值相近二、PCR反应条件模板： 质粒DNA，扩增后的DNA，cDNA ，基因组DNA（机械剪切或稀

7、有限制酶酶切），单链和双链， 拷贝数102-105引物： 常用浓度0.1-0.5uM, 分装小管保存dNTP 20-200uM，4种dNTP终浓度相等Mg2+浓度 0.5-2.5mMpH半衰期 92.5 2h 95 40min 97.5 5-6min错误参入率: 每2x104核苷酸中有一个 无3-5外切酶活性,无校对活性3端加poly(dA),非模板依赖碱基,T载体100L反应体积中用量0.5-5U最适反应温度: 726.1.6 Taq酶(DNA聚合酶)PCR反应的忠实性 Taq酶没有3-5的外切活性而不能自行校正，从而导致错掺测序、定点诱变和克隆减少错掺的对策： 加入Taq酶后迅速反应，避免

8、低温下进行的链延伸；酶浓度不可过大；dNTP 不可过浓；Mg2+浓度适中6.1.7 PCR平台效应定义：PCR进行到一定次数后产物的积累由指数方式 向线性方式变化或反应根本停止。原因：酶的热失活抑制酶活的物质dNTP的稳定性非特异性片段的竞争模板的自身退火酶与dNTP的相对减少6.1.8 容易污染PCR反应的灵敏度高,极易产生假阳性结果(一定要做阴性对照)污染来源： 样品污染即样品间的交叉污染 产物污染 其它污染：环境污染和实验使用的器材试剂防治方法：短波紫外线照射30分钟；器皿类可用稀酸碱泡，使碱基脱嘌呤；PCR管、枪头等一次性使用；试剂湿热灭菌后小管分装；加模板DNA后盖紧盖子，打开盖子前

9、离心甩下小液滴，再慢慢打开，防止开盖过快，形成气溶胶。每次反应都应设立阳性，阴性对照。实验操作Section 26.2.1 实验材料仪器：PCR扩增仪 琼脂糖凝胶电泳系统材料： DNA模板 4种dNTP 引物1，2 Taq酶1、DNA模板的制备(挑取细菌沉淀)2、引物设计与合成(教师已做)3、PCR扩增GFP基因4、琼脂糖电泳检测6.2.2【实验步骤】1、DNA模板的制备质粒DNA扩增后的DNAcDNA基因组DNA(机械剪切或稀有限制酶酶切)重组细菌(本次试验DH5a/pET28a-EGFP)单链和双链,拷贝数102-1052、本次实验引物的设计与合成P1 XhoI5GC CTC GAG CT

10、T GTA CAG CTC GTC CAT G3 P2 EcoRI5GC GAA TTC GTG AGC AAG GGC GAG G3上海申工生物技术有限公司3、PCR扩增GFP基因 实验管(1#,2#,3#) 阴性对照管(-) ddH2O 17.5L 17.5L 10 xbuffer 2.5 L 2.5 L 2.5mMdNTPs 2.0 L 2.0 L Primer1 1.0 L 1.0 L Primer 2 1.0 L 1.0 L Template DNA (细枪头粘菌) Taq 1.0 L 1.0 L 反应总体积 25 L 25 L混合于EP管中且混匀,Short离心4、琼脂糖电泳检测制胶: 配置25ml 1%琼脂糖凝胶(2人配一块胶,使用11个小齿的梳子)。（不知道如何配置的同学问老师）上样电泳: 1. A1(1#) 10 l 2. A1(2#) 10 l 3. A1(3#) 10 l 4. A1(-) 10 l 5. DNA Marker 5 l 6. A2(1#) 10 l 7. A2(2#) 10 l 8. A2(3#) 10 l 9. A2(-) 10 l电泳: