生物化学与分子生物学实验：4-分光光度法

1、分光光度法内容3分光光度法的原理1如何求被测组分的含量2分光光度计的基本结构分光光度计的使用与注意事项43分光光度法概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。分光光度法分类紫外分光光度法（200400nm）可见分光光度法（400760nm）红外分光光度法（76010000nm）分光光度法的原理-1Lambert-Beer定律即：I0=IA+IR+IT（所用比色皿同质料同规格，反射光强度为一定值） 故：I0 =IA+ ITI0IT入射光强度透过光强度LC液层厚度溶液浓

2、度IA反射光强度IR吸收光强度分光光度法的原理-2由式中可知：当入射光强度I0为一定时，被吸收光强度IA愈大，则透过光强度IT愈小。即透过光强度减弱仅与有色溶液对光线的吸收有关。实验证明：溶液质量浓度C愈大，深层厚度L愈厚，则溶液对光线吸收得愈多。分光光度法的原理-3它们之间的关系是：分光光度法的原理-4分光光度法的原理-5如何求被测组分的含量1.利用标准管计算测定物的含量2.利用标准曲线计算测定物含量3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定同种已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同时也测定末知浓度（CU）的吸光度

3、（AU），利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 标准曲线(浓度-吸光度曲线）0.20.80.40.6A 0 1 2 3 4 5根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 C分光光度计的基本结构光源单色光器吸收池检测器显示钨丝灯可见光源3501000nm氢灯氘灯紫外光源 2003

4、60nm棱镜衍射光栅玻璃比色杯石英比色杯硒光电池光电管光电倍增管玻璃能吸收UV光，仅适用于可见光区。石英不吸收紫外光，适于紫外和可见光区。将光信号转变为电信号的装置。记录装置：讯号处理和显示系统。V-1100型可见光分光光度计 0.000ATCFMODEPRINT0%T100%TA：吸光度T：透射比C：浓 度F：斜 率MODEATCF切换键PRINT确认键0%T100%T校零、下降键校100、上升键V-1100分光光度计键盘控制的使用说明 V-1100分光光度计操作步骤开机，预热30分钟。转动波长旋钮，调所需波长。按 键切换到T档。将黑体放入光路中，合上盖，按 键校零,T=000.0。开盖，将

5、参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键校T=100.0合上盖，按 键切换到A档 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸光度A值。重复3次，记录3组数据。读数后，将黑体放入光路中，开盖取出比色杯。将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并倒扣在滤纸上晾干关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。MODE 0%MODE 100%V-1100分光光度计 使用注意事项注意防震、防潮、防光和防腐蚀。每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调换。不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。盛装参比液时，达到比色杯的3/4即可，不宜过多，以防溶液溢出。比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸拭净。注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗。测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。操作练习实验材料试剂： CuSO4标准液 （8mg/ml） 待测CuSO4溶液 蒸馏水器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架 V-1100型可见光分光光度计操作练习步骤加入物 B S U蒸馏水 3ml CuSO4标准液 3ml CuSO4待测液 3ml分别取3支试管，做好标记，按下表操作： 以空白管B调零，在690nm处，读取标准管S和待测管U吸光度A值，记录3组数据，取平均A值，代入公式计算。数